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    上皮细胞类培养实验

    发布时间: 2023-06-06  点击次数: 383次

    实验原理:

    利于皮肤表皮细胞实验">培养成功的因素有,在有胶原的底物上易生长;另有人发现把人或小鼠表皮细胞培养在以3T3 细胞为饲养层(用射线照射后)上时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低pH、Ca2+的含量和温度等,均利于表皮细胞生长。向培养基中加氢化可的松( 10 μg/ml )、10-10 的霍乱毒素、10M-6 的异丙基肾上腺素(Isopro-terenol)和10 ng/mI 促表皮生长因子(EGF)能促表皮细胞生长。


    方法:

    皮肤是皮表细胞培养来源,小儿包皮是皮肤表皮细胞培养的好材料。全皮培养时,表皮细胞与成纤维细胞混合生长,难以纯化。黑木登志夫(1981)用皮肤表皮和真皮分离培养法可获纯上皮细胞,有一定参考价值,其法如下:

     

    1.  取材

    取外科植皮或手术残余皮肤小块,以角化层薄者为佳,早产流产儿皮
    肤更好,切成 0.5~1 平方厘米小块;

    2.  EDTA处理

    先置入0.02 %EDTA 中室温置5 分钟;

    3.  冷消化

    换入0.25 %胰蛋白酶中,置4 ℃过夜;

    4.  分离

    取出皮块,用血管钳或镊子把表皮与真皮层分开;

    5.  温消化

    取出表皮单独处理,用剪刀剪成更小的块后,置入新的0.25 %胰蛋
    白酶中,37 ℃再消化30~60 分钟;

    6.  用吸管轻轻反复吹打,使成细胞悬液;

    7.  培养液

    通过80 目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸上清,直接加入Eagle液和 20 %小牛血清,制成细胞悬液,接种入碟皿中,CO2温箱培养。


    注意事项:

    冷消化目的在于使表皮和真皮结合松散,如冷消化后分离下来的表皮膜自身也已松散,此时亦可直接置入PBS中用吸管吹打制备细胞悬液;不再经过第二次消化。


    其他:

    皮肤表皮培养亦可用全皮消化法或组织块培养法培养。用胶原酶消化为好,它对结缔组织有较强消化作用,对表皮细胞损伤小,但成纤维细胞易与上皮细胞同时生长,在这种情况下,需做排除成纤维胞处理。血清中含有血小板来源的生长因子(PDGF),易促成纤维细胞的生长;如用好的、不含PDGF的无血清培养基培养可能更好。