日本 1 型糖尿病患者放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法

比较日本 1  型糖尿病患者放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法的胰岛素瘤相关抗原 2   自

身抗体的临床意义和抗原特异性

川崎英二、 1 岛田晃、 2 今川明久、 3 阿比留夫、4 粟田拓哉、 5  及川洋 一 、 2 大泽春 彦、 6  川端由美子、 7  小泽润二、 8 小林哲朗、 9 高桥和马、 10  中条大辅、 11 友福井 康、 12 三浦淳之介、 13 安田和树、 14 安田久文、 15  梶尾博、 16 花房 敏明 、 17池  上 博、 7 与 日本糖尿病学会 1  型糖尿病委员会

目标/简介

本研究旨在通过放射免疫分析（RIA；IA-2A-RIA）和酶联免疫吸附分析（ELISA；IA-2A-ELISA） 探讨胰岛素瘤相关抗原 2（IA-2A） 自身抗体的临床意义和抗原特异性。 ）在日本 1  型糖

尿病患者中。

材料和方法

共有 338  名 1  型糖尿病患者入组，其中 38  名暴发性 1  型糖尿病、168  名急性发作 1   型糖尿病和 137  名缓慢进展 1  型糖尿病 (SPIDDM)。检查了自身抗体滴度的一致性、相关 性以及 IA-2A  与胰岛素缺乏状态进展之间的关系。此外，还使用竞争性测定来检查抗原特

异性。

结果

在急性发作的 1  型糖尿病和 SPIDDM   中，IA-2A-ELISA   的患病率比 IA-2A-RIA  低 4-5%， 但与谷氨酸脱羧酶联合测量时，两种亚型的诊断敏感性均较高自身抗体，具有可比性。使用

RIA  或 ELISA  方法诊断 1  型糖尿病与 RIA  和 ELISA  检测到的自身抗体滴度的指数相关

性基本一致。在 SPIDDM  患者中，ELISA  法（而非 RIA  法）IA-2A   阳性病例的空腹 C  肽 显着低于阴性病例（ P < 0.05 ） 。此外，IA-2A-ELISA  在预测 SPIDDM  胰岛素缺乏进展方 面优于 RIA  方法。竞争性分析表明，即使 RIA  和 ELISA  结果不一致的血清也含有 IA-2  特

异性自身抗体。

结论

这些结果表明，IA-2A-ELISA  不仅是诊断 1  型糖尿病的可靠标志物，而且还可用于预测未 来的胰岛素依赖性；也就是说，IA-2A-ELISA  检测有助于识别可能进展为胰岛素缺乏状态的

SPIDDM  患者亚型。

关键词： 自身抗体、 自身抗原、胰岛素瘤相关抗原 2 、1  型糖尿病

在本研究中，我们表明，RSR Ltd.（英国卡迪夫）对胰岛素瘤相关抗原 2   自身抗体 (IA-2A)  进行的放射免疫测定 (RIA)  和酶联免疫吸附测定 (ELISA)  的一致性为 94.7%暴发性 1  型 糖尿病( κ  统计量 = 0.000，95%  置信区间 0.000–0.000），急性发作 1  型糖尿病为 89.3%          ( κ  统计量 = 0.786，95%  置信区间 0.693–0.879），缓慢进展型 90.5% 1  型糖尿病( κ  统 计量 = 0.769 ，95%  置信区间 0.651–0.888）， 以及与谷氨酸脱羧酶自身抗体联合测量时，

RIA  和 ELISA  方法对自身免疫介导的 1  型糖尿病的诊断敏感性相当。此外，我们报道，

RSR IA-2A-ELISA  比 RSR IA-2A-RIA  在识别可能进展为胰岛素缺乏状态的缓慢进展 1  型

糖尿病患者的亚型方面更有用。

去：

介绍

胰岛素瘤相关抗原 2 (IA-2A)   自身抗体是预测和诊断 1  型糖尿病的重要血清学标志物。糖 尿病自身抗体标准化计划或胰岛自身抗体标准化计划的制定是为了标准化和提高实验室的  抗胰岛自身抗体检测性能1, 2  。在参与这些标准化计划的实验室中，放射性配体结合测 定在检测 IA-2A 2  方面表现出显着的一致性，同时也开发了各种方法学改进。这些方法包 括 RSR Ltd.（英国卡迪夫）的放射免疫测定 (RIA)  和酶联免疫吸附测定 (ELISA) ，这两种 方法都是用于分析 IA-2A  的成熟测试，并作为商业试剂盒在世界各地广泛分布。这些试剂 盒已被证明表现良好，在糖尿病自身抗体标准化计划 IA-2A  研讨会上实现了高灵敏度和特 异性1  。最近， 日本 IA-2A 测量已从 RSR-RIA 转向 RSR-ELISA ，因此有必要改变解释和对 应关系，包括 RIA 方法的阳性/阴性判断。因此，我们将本研究作为日本糖尿病协会 1  型  糖尿病委员会的一个研究项目进行，旨在调查使用 RSR-RIA  和 RSR  测量 IA-2A  值不一致 的日本 1  型糖尿病患者的临床特征-ELISA。此外，我们进行了竞争性测定，以评估 RSR-RIA

和 RSR-ELISA  之间 IA-2A  结果的差异是否是由于非特异性结合造成的。

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材料和方法                                                                       

参加者

通过日本糖尿病协会委员会和日本 1  型糖尿病数据库 (TIDE-J)  研究，从 10  个参与本研

究的机构收集了总共 343  份 1  型糖尿病患者的血清样本。TIDE-J  研究的纳入标准之前已 描述过3  。这项研究包括 38  名暴发性 1  型糖尿病患者、168  名急性发作 1  型糖尿病患

者和 137  名缓慢进展 1  型糖尿病 (SPIDDM)  患者，1  型糖尿病的诊断是根据委员会制定 的标准做出的。 日本糖尿病学会4, 5, 6  。患者临床特征详情见表1 。如果患者在病程中

的任何时间谷氨酸脱羧酶自身抗体（GADA）和/或胰岛细胞抗体呈阳性，则诊断为 SPIDDM， 无论研究时的抗胰岛自身抗体状态如何。25  名 SPIDDM  患者在诊断时发现糖尿病酮症酸  中毒，包括软饮料酮症（酮症酸中毒）。研究方案得到了日本糖尿病学会伦理委员会和参与

该项目的各机构的批准，并获得了所有参与者的知情同意。血清样本保存在-20°C 直至使用。

表格 1

临床特点

BMI ，身体质量指数；DKA ，糖尿病酮症酸中毒；GADA ，谷氨酸脱羧酶自身抗体；F-CPR，

空腹 C 肽；HLA ，人类白细胞抗原；RIA ，放射免疫分析；SPIDDM ，缓慢进展的1型糖尿

抗胰岛自身抗体测定

RSR-RIA IA-2A (IA-2A-RIA)  通过液相 RIA  测定，使用 125 I  标记的重组人 IA-2  作为示踪 剂，如前所述7  。结果是从使用校准品在同一运行中构建的校准曲线中读取的，并以 U/mL

表示。IA-2A-RIA  的截止值为 0.4 U/mL 。如前所述，RSR-ELISA IA-2A (IA-2A-ELISA)  和

GADA  分别使用生物素化 IA-2  和 GAD65  使用二价 ELISA  进行测定8  。结果是从使用校

准品在同一运行中构建的校准曲线中读取的，并以 U/mL  表示。IA-2A-ELISA  和 GADA   的

截止值分别为 0.6 U/mL  和 5.0 U/mL 。IA-2A-RIA   的分析内和分析间变异系数分别为

2.5–2.8%  和 3.8– 5.3% ，而 IA-2A-ELISA   的分析内和分析间变异系数分别为 2.0– 3.3%  和 4.0–6.5% 9  。在 2018  年胰岛自身抗体标准化计划研讨会（实验室 ID：1801）中，IA-2A 的检测灵敏度和特异性分别为 72%  和 98% ，GADA   的检测灵敏度和特异性分别为 90%

和 98%。

竞争分析

通过使用未标记的重组人 IA-2  的竞争性结合实验来检查抗原特异性。检测格式与 RSR-RIA 和 RSR-ELISA  相同。最初，为了确定重组 IA-2  蛋白的最佳量，将五种高水平 IA-2A  血清

与三种不同浓度的未标记 IA-2（从 2.5 μg  到 250 μg/mL  不等）在室温下孵育 1  小时，

在进行 IA-2A  测量之前（图S1）。基于该初步实验，使用 250 μg/mL  未标记的 IA-2  蛋 白进行了进一步的竞争测定。添加重组 IA-2  蛋白后表现出抑制作用的血清样品的百分比按

下式计算：[（不含竞争剂的 U/mL -  含竞争剂的 U/mL）/不含竞争剂的 U/mL] × 100。

统计分析

所有结果均表示为平均值±标准差或中位数（范围），并在适当的情况下使用 χ 2 检验和

Fisher  精确检验对分类变量进行比较。使用 Mann–Whitney U 检验或 Kruskal –Wallis  检验  检验非参数数据的差异，并使用 Spearman  等级相关检验分析自身抗体滴度之间的相关性。 使用各种回归模型进行曲线拟合分析，包括线性、二次、指数和倒数模型，以确定适合  IA-2A-RIA  水平和 IA-2A-ELISA  水平之间的相关性，以及持续时间之间的相关性。 SPIDDM  和自身抗体水平。根据 IA-2A  的 RIA/ELISA  结果将患者分为四组，如下： 第 1  组（RIA  阳性/ELISA  阳性）；第 2  组（RIA   阳性/ELISA  阴性）；第 3  组（RIA   阴性/ELISA  阳性）； 和第 4  组（RIA   阴性/ELISA   阴性）。IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之间的一致性通过 κ  统 计量进行评估，该统计量是从 0  到 1 10  范围内一致性强度的度量。还进行了多元逻辑回

归分析，评估 IA-2A  阳性与临床和免疫遗传学参数之间的关联。P 值<0.05 被认为具有统计 学意义。本研究的统计分析是使用 StatView  统计软件（5.0  版；SAS Institute ，卡里，北  卡罗来纳州，美国）和 SigmaPlot  软件（14.5  版；Systat Software Inc. ，圣何塞，加利福

尼亚州，美国）进行的。

IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 的患病率和一致性

暴发性 1  型糖尿病各亚型的 IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  患病率分别为 0  和 5%，急性发 作 1  型糖尿病为 51%  和 46% ，SPIDDM  为 31%  和 27% 。因此，在急性发作的 1  型  糖尿病和 SPIDDM  中，IA-2A-ELISA  的患病率比 IA-2A-RIA   的患病率低 4-5% 。然而，当 与 GADA（日本健康保险下第一个测量的抗胰岛自身抗体）联合测量时，RIA  和 ELISA  方 法对自身免疫介导的 1  型糖尿病的诊断敏感性相当（图 S2 ）。急性发作 1  型糖尿病和  SPIDDM  中 IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之间的一致性如图所示1。两种亚型中大约 7%  和 3%  的患者分别仅 IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  呈阳性。此外，对于暴发性 1  型糖尿病，

IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之间的一致性为 94.7%( κ  统计数据 = 0.000，95% 95%  置信

区间 0.000–0.000），对于暴发性 1  型糖尿病，一致性为 89.3%( κ  统计数据 = 0.786，

急性发作 1  型糖尿病为 95%（95%  置信区间 0.693–0.879），SPIDDM  为 90.5%( κ  统 计量 = 0.769 ，95%  置信区间 0.651–0.888；表2）。使用线性和非线性回归进行曲线拟合 分析，以确定哪个适合 IA-2A-RIA  水平和 IA-2A-ELISA  水平之间的相关性（表 S1 ）。 在急性发作的 1  型糖尿病和 SPIDDM   中，指数回归模型比其他模型更适合（图2a,b）。我

们还分别对 IA-2A-RIA <20 U/mL  范围的患者进行了相同的分析，指数回归曲线仍然适合 两种亚型（图 S3 ）。

(a)急性发作型1型糖尿病和(b)缓慢进展型糖尿病患者放射免疫测定(RIA)和酶联免

疫吸附测定(ELISA)检测胰岛素瘤相关抗原2(IA-2A)结果的一致性 1糖尿病。

表 2

放射免疫测定的胰岛素瘤相关抗原2与酶联免疫吸附测定1型糖尿病血清的胰岛素瘤相

关抗原2之间的一致性

1 型糖尿病患者

暴发性 1 型糖尿 病

急性发作的 1 型 糖尿病

SPIDDM

放射免疫分析 n    (+)

38     0 (0%)

168    85 (51%)

137    42 (31%)

酶联免疫吸附测

定 (+)           协议   κ 统计（95% CI）

2 (5%)      94.7% 0.000（0.000 –0.000）

77 (46%)     89.3%         0.786

(0.693 –0.879)

37 (27%)     90.5%         0.769

(0.651 –0.888)

CI ，置信区间；ELISA ，酶联免疫吸附测定；RIA ，放射免疫分析；SPIDDM ，缓慢进展的1

(a)急性发作型1型糖尿病和(b)缓慢进展型糖尿病患者中放射免疫测定(RIA)和酶联

免疫吸附测定(ELISA)测定的胰岛素瘤相关抗原2(IA-2A)水平之间的相关性 1糖尿病。

本分析中使用了任一测定的自身抗体阳性血清。

基于 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 阳性的急性发作 1   型糖尿病患者的临床和免疫遗传学特征

桌子3根据 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 的阳性或阴性结果，总结了四组急性发病 1 型糖尿病 患者的临床和免疫遗传学特征。四组之间在性别、发病年龄、糖尿病病程、发病时糖尿病酮 症酸中毒患病率、体重指数、空腹 C 肽（F-CPR）水平、平均 GADA 水平和疾病频率方面没

有显着差异易感 HLA-DRB1*04:05  和 -DRB1*09:01 。然而，四组之间的 GADA  患病率存

在    显着差异。在 IA-2A-RIA  阳性 ( P  = 0.0047)  和 IA-2A-ELISA   阳性患者 ( P  =

0.0039)中观察到 GADA  患病率显着较高。此外，第 1  组 (RIA + /ELISA +)的平均 IA-2A

水平显着高于第 2  组 (RIA + /ELISA - )  或第 3  组 (RIA - /ELISA + )。

表 3

168例急性发作1型糖尿病患者的临床特征（按组别）

第 3 组

（RIA 阴

第 1 组（RIA   第 2 组（RIA    性且        第 4 组（RIA

阳性和 ELISA   阳性且 ELISA   ELISA 阳    阴性和

阳性）          阴性）          性）        ELISA 阴性）  P 值

n                72               13               5           78

女性            46 (64%)        8 (62%)         4 (80%)     43 (55%)      NS

发病年龄（岁） 39.0±18.4     43.1±19.8     48.4±22.5 42.0±16.5   NS

持续时间（年） 3.3±4.2        2.0±2.9        2.0±2.4   4.4±7.2     NS

发病时 DKA      50/22           12 月 1 日       3/2         53/25         NS

(+/-)

体重指数（公斤/ 21.0±3.3       20.1±2.3       21.5±6.0  20.8±3.0    NS

米 2）

F-CPR (ng/mL)  0.53±0.46     0.36±0.28      1.03±1.28 0.64±0.81   NS

嘎达 (+)        64 (89%)        9 (69%)         3 (60%)     53 (68%)      0.015

伽达 (U/mL)     1,000.8±906.5 929.4±1,017.0 748.8 ±   690.7±807.2 NS

1,086.8

IA-2A-RIA       9.9±11.4       1.6±1.0        不适用      不适用        <0.0001

(U/mL)

IA-2A-ELISA     153.2±427.4   不适用          1.6±1.0   不适用        0.012

(U/mL)

HLA-DRB1*04:05 25/112 (26%)   5/14 (36%)      1/6 (17%)  30/120 (25%) NS

(+)

HLA-DRB1*09:01 36/112 (40%)   4/14 (29%)      2/6 (33%)  30/120 (25%) NS

(+)

测定相应自身抗体阳性患者的自身抗体水平。

BMI ，身体质量指数；DKA ，糖尿病酮症酸中毒；ELISA ，酶联免疫吸附测定；F-CPR ，空腹

C 肽；GADA，谷氨酸脱羧酶自身抗体；HLA，人类白细胞抗原；RIA，放射免疫分析；SPIDDM，

缓慢进展的1型糖尿病；NS ，不显着。

基于 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 阳性的 SPIDDM 患者的临床和免疫遗传学特征

桌子4显示四组 SPIDDM  患者的临床和免疫遗传学特征。值得注意的是，第 4  组的糖尿病

病程明显长于第 1  组，并且四组之间的 F-CPR  水平也有显着差异。IA-2A-ELISA  阳性

SPIDDM  患者的 F-CPR  显着低于 IA-2A-ELISA   阴性患者（表S2 ，P  = 0.006）。然而，

IA-2A-RIA  阳性和阴性患者的 F-CPR  水平没有差异。同样，与急性发作的 1  型糖尿病结果

一样，四组中 GADA  的患病率存在    显着差异，并且第 1  组的平均 IA-2A  水平 (RIA +

/ELISA + )  显着高于第 2 组(RIA + /ELISA - )  或第 3  组 (RIA - /ELISA + )。对于 II  类 HLA，

IA-2A-ELISA  阳性患者中 HLA-DRB1*04:05  和 DRB1*09:01  等位基因频率分别为 32%

(19/60)  和 62% (34/60) ，31 IA-2A   阴性患者中分别为 % (42/134)  和 30% (40/134) 。  因此，HLA-DRB1*09:01（而非 DRB1*04:05）仅与 IA-2A-ELISA  阳性相关（P = 0.0004）。 调整临床和免疫遗传学参数（发病年龄、性别、持续时间、GADA  阳性和 HLA-DRB1*09:01  的存在）后，IA-2A-ELISA  阳性相关，但 IA-2A-RIA  阳性不相关，HLA-DRB1*09:01  仍然

显着（表S3）。

表 4

137例缓慢进展1型糖尿病患者的临床特征（按组）

第 1 组（RIA  第 2 组（RIA  第 3 组（RIA   第 4 组（RIA

阳性和 ELISA  阳性且        阴性且 ELISA   阴性和

阳性）         ELISA 阴性）  阳性）         ELISA 阴性）  P 值

F-CPR (ng/mL)  0.91±0.81     1.76±1.88   0.53±0.27     1.70±1.46** 0.042

嘎达 (+)        32 (97%)       5 (56%)       3 (75%)        45 (49%)      <0.0001

伽达 (U/mL)     1191.3±950.0 134.4±169.3 800.8±1053.8 658.8±847.6 NS

IA-2A-RIA       12.2±10.3     1.0±0.4      不适用         不适用        <0.0001

(U/mL)

IA-2A-ELISA    95.7±178.4   不适用        1.4±0.8       不适用        0.030

(U/mL)

HLA-DRB1*04:05 19/56 (34%)   8/16 (50%)   0/4 (0%)       34/118 (29%) NS

(+)

HLA-DRB1*09:01 31/56 (55%)   2/16 (13%)   3/4 (75%)      38/118 (32%) <0.0001

(+)

测定相应自身抗体阳性患者的自身抗体水平。

BMI ，身体质量指数；DKA ，糖尿病酮症酸中毒；ELISA ，酶联免疫吸附测定；F-CPR ，空腹

C 肽；GADA ，谷氨酸脱羧酶自身抗体；HLA ，人类白细胞抗原；不适用，不适用；NS ，不

显着；RIA ，放射免疫分析。

虽然患者在糖尿病病程中应至少有一种自身抗体（主要是 GADA）来诊断 SPIDDM ，但在病 程较长的患者中，一些自身抗体可能会消失。因此，我们研究了 SPIDDM  患者病程与自身

抗体患病率和水平之间的关系。GADA 的患病率高于 IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA ，并且在整

个病程中缓慢下降。IA-2A-RIA  和 IA-2A-ELISA  之间的阳性率随疾病持续时间的下降相似 （图3）。因此，对于病程≥5 年的患者，SPIDDM 的诊断敏感性下降至 51% 。 自身抗体阳

性患者的病程与自身抗体水平之间没有关联（图S4）。

缓慢进展1型糖尿病患者抗胰岛自身抗体阳性与糖尿病病程的相关性。ELISA ，酶联免疫

吸附测定；GADA，谷氨酸脱羧酶自身抗体；RIA，放射免疫分析。*与1-2年组相比，P< 0.05；

** 与<1 、1-2和3-5岁组相比，P<0.05 。

SPIDDM 患者进展为胰岛素缺乏状态与 IA-2A 阳性之间的关联

由于 IA-2A-ELISA（而非 IA-2A-RIA）的存在与 SPIDDM  患者的内源性胰岛素分泌较低相

关，因此我们还分析了 57  名 TIDE-J SPIDDM  患者中 F-CPR   的连续变化。 自入组后的 3     年中，57  名患者中有 32  名 (56%)  进展为胰岛素缺乏状态，定义为 F-CPR <0.6 ng/mL 5  。

桌子5显示 SPIDDM  患者进展者和非进展者之间的临床特征。与非进展者相比，进展者的  特点是发病年龄较小、体重指数较低、发病时糖尿病酮症酸中毒频率较高、入组时 F-CPR  较  低以及 GADA  频率较高。此外，进展组中 F-CPR  较基线下降的百分比 (ΔF-CPR)  显着低   于非进展组。进展组中 IA-2A-ELISA   阳性 SPIDDM  的频率显着高于非进展组（53% vs 16%，

P = 0.006），而 IA-2A-RIA   的频率没有差异两组之间。此外，IA-2A-ELISA  阳性患者的平

表 5

缓慢进展 1 型糖尿病患者进展者和非进展者的临床特征

测定相应自身抗体阳性患者的自身抗体水平。ΔF-CPR表示空腹C肽相对于基线的百分比

BMI ，身体质量指数；DKA ，糖尿病酮症酸中毒；ELISA ，酶联免疫吸附测定；F-CPR ，空腹

C 肽；GADA ，谷氨酸脱羧酶自身抗体；HLA ，人类白细胞抗原；不适用，不适用；NS ，不

显着；RIA ，放射免疫分析。

IA-2A-RIA 和 IA-2A-ELISA 之间 1  型糖尿病患者 IA -2  的抗原特异性存在差异

To elucidate whether the discrepancy in IA-2A results between RIA and ELISA is associated

with non-specific binding to IA-2 antigen, we carried out competitive binding experiments

with unlabeled recombinant IA-2 protein. These experiments used 31 sera from group 2 and 22 from group 1 using the RIA method, whereas 12 sera from group 3 and 19 from group 1     were employed using the ELISA method. The percentage of inhibition was 91.3 ± 10.4% for

group 2 and 93.9 ± 5.7% for group 1 using the RIA method, and 97.7 ± 7.8% for group 3 and

100.0 ± 0.0% for group 1 using the ELISA method, respectively. Additionally, the levels of

IA-2A turned negative in all sera used in these experiments after adding 250 μg/mL of

unlabeled IA-2 protein.

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DISCUSSION                                                                                                                                                               

In the present study, we showed that: (i) the prevalence of IA-2A-ELISA was 4– 5% lower

than that of IA-2A-RIA; (ii) the concordance rate for both IA-2A assays was 90 – 95% for

type 1 diabetic patients; (iii) the IA-2A-ELISA was a more useful marker than the RIA method for identifying SPIDDM patients who progress to the insulin-deficient state at an early stage;

and (iv) both IA-2A assays detected antigen-specific autoantibodies. When measured in

combination with GADA, the two different commercial assay kits used to measure IA-2A by    RIA or ELISA were almost equivalent in diagnostic sensitivity. Therefore, as GADA is the first

anti-islet autoantibody in line to be measured under Japanese health insurance, the

IA-2A-ELISA makes for a suitable alternative method to the discontinued RIA method for the

diagnosis of autoimmune-mediated type 1 diabetes in patients with acute-onset type 1

diabetes and SPIDDM. However, it is not perfect, as we found that the correlation between  IA-2A levels by RIA and ELISA (r = 0.65–0.77) was lower than in the case of GADA-RIA and  GADA-ELISA (r > 0.8), which was consistent with a previous report1   . These results show that, in patients with type 1 diabetes, it might be difficult to estimate the IA-2A-ELISA level

from the antibody level of the IA-2A-RIA. The discordant results between the two assays

might be related to the discordant epitopes ofIA-2 peptide recognized by the RIA and the

ELISA methods, although the IA-2 molecules used in these two kits are identical.

To compare the clinical significance of IA-2A-RIA and IA-2A-ELISA, patients with type 1

diabetes were divided into four groups based on the positivity of both methods, and the

clinical characteristics in patients with acute-onset type 1 diabetes and SPIDDM were

compared (Tables3 and and4).4). In addition to a higher frequency of GADA in

IA-2A-positive patients than in IA-2A-negative patients, the IA-2A levels in group 1 were

significantly higher than in group 2 (RIA) or group 3 (ELISA) in both type 1 diabetes

subtypes. However, as both assays detected IA-2-spcific autoantibodies in our competitive binding experiment, we believe this outcome might be related to the different epitopes or

affinities of IA-2A between the patients positive for both RIA and ELISA and those with

discrepant results.

Interestingly, patients with SPIDDM who were positive for IA-2A-ELISA had a higher

frequency of HLA-DRB1*09:01 than IA-2A-ELISA-negative patients (Table4). Furthermore,

logistic regression analysis showed that IA-2A-ELISA positivity, but not IA-2A-RIA positivity,

was independently associated with the presence of HLA-DRB1*09:01 (TableS3). The

previous studies reported that HLA-DRB1*09:01 was susceptible HLA class II allele in

SPIDDM patients, and the prevalence of IA-2A was higher in those carrying

HLA-DRB1*09:0111, 12, 13  . Thus, it is speculated that the association between SPIDDM

patients and HLA-DRB1*09:01 might be due to the presence of IA-2A.

Regarding patients with SPIDDM, it is important to identify which predictive marker is best

for identifying the progression to the insulin-deficient state, as this could assist in

maintaining good glycemic control and, therefore, avoid diabetic complications. Previous

reports state that high titer, high affinity and the middle-epitope of GADA act as predictive

markers of future insulin dependency in patients with SPIDDM14, 15, 16  . Furthermore,

screening for other anti-islet autoantibodies was shown to help increase the predictive

power regarding GADA-positive SPIDDM14, 15  . As IA-2A-ELISA-positive SPIDDM

patients had a lower F-CPR than IA-2A-RIA-positive individuals in our cross-sectional

dataset, we further investigated whether IA-2A-ELISA is superior to IA-2A-RIA in predicting insulin-deficiency by using the longitudinal dataset in the TIDE-J study. As shown in Table 5, the prevalence of IA-2A-ELISA, but not IA-2A-RIA, was significantly higher in the progressor group than in the non-progressor group. Furthermore, there was a significant relationship

between ∆F-CPR and IA-2A-ELISA positivity, but not IA-2A-RIA positivity. These results

suggest that IA-2A-ELISA is more useful than IA-2A-RIA in identifying high-risk SPIDDM

patients associated with the faster decline in β -cell function, as well as early progression to

the insulin-dependent state. In patients with SPIDDM, it has been reported that patients with

low-affinity anti-islet autoantibodies have prolonged preservation of residual β -cell

function16  . Furthermore, the IA-2A-ELISA used in the present study utilizes the same        principle, bivalent autoantibody method, as the RSR GADA-ELISA, which has been reported  to detect only high-affinity antibodies8   . With all these factors considered, it is speculated  that the discordance between IA-2A-ELISA and IA-2A-RIA in predicting disease progression

might be linked to the diversity of autoantibody affinity detected by each assay.

The present study had several limitations to report. First, the number of participants was

relatively small, which might affect the concordance rate and correlation between the two

assays. Therefore, further investigation using a larger cohort is required to confirm our

results. Second, the duration of type 1 diabetes after onset in participants varied from short

to long, so further investigations involving new-onset patients are necessary. Third, the

participants in this study did not include childhood-onset type 1 diabetes, so further

investigation involving those patients is warranted.

In summary, the present study showed that the IA-2A-ELISA is a reliable marker not only for

the diagnosis of type 1 diabetes, but also for the prediction of SPIDDM progression when

compared with the IA-2A-RIA. We conclude that using ELISA to detect IA-2A might help

identify a subtype of SPIDDM patients who would likely progress onto an insulin-deficient

state.

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DISCLOSURE                                                                                                                                                              

Akihisa Imagawa received honorarium or consultation fees from Astellas Pharma Inc.; grants

or research support from Astra Zeneca K. K., Taiho Pharmaceutical Co., Ltd., Daiichi Sankyo

Co., Ltd., Merck Biopharma Co., Ltd., Parexel International Inc., Shionogi Co., Ltd., Sumitomo

Dainippon Pharma Co., Ltd. and Takeda Pharmaceutical Co., Ltd.; Daisuke Chujo received

honorarium for lectures from Eli Lilly and Company, Tomoyasu Fukui received research

funding from Cosmic Corp. Junnosuke Miura received honorarium for lectures from Taisho     Pharmaceutical Co., Ltd., Novo Nordisk Pharma Ltd., Novartis Pharma KK, Eli Lilly Japan K.K.,

Sanofi K.K., Johnson & Johnson K.K., Abbott Japan LLC, Terumo Corporation, Boehringer

Ingelheim Co., Ltd., Kyowa Kirin Co., Ltd., Takeda Pharmaceutical Company Limited,

Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation, MSD K.K., Mylan EPD G.K., Kowa Company, Ltd.,

Astra Zeneca K.K. and Astellas Pharma Inc.; medical consult fees from Kanro Inc.; and

manuscript fees from Novo Nordisk Pharma Ltd. The other authors declare no conflict of

interest.

Approval of the research protocol: This study protocol was approved by the Ethics

Committee of Japan Diabetes Society.

Informed consent: Informed consent was obtained from all participants.

Registry and the registration no. of the study/trial: Approval date of Registry 1 November

2018, and approval number 30-008-(2).

Animal studies: N/A.