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    细胞素信号为哺乳动物的组织模式提供了重要的贡献

    发布时间: 2024-01-11  点击次数: 353次


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    作者 埃里克·T.霍尔,Miriam E。
        迪拉德,伊丽莎白R.克莱维登,...,
        卡门辛德·罗宾逊,
        杰弗里·斯坦伯格,史黛西K.奥格登

     函件stacey.ogden@stjude.org

     简言之在神经管发育过程中,细胞素,特的信号传导
    丝状伪足,有助于声音刺猬和WNT的分散,以确保
    适当的细胞命运的决定
    通过腹侧和背侧的形态发生信号梯度。
    派出
    促进声音刺猬的内吞循环,促进配体进入细胞素。

     

     

     

    亮点

    .    发出的分裂促进了声音刺猬的内吞作用

    循环和胞质负载

    .    细胞素有助于声音刺猬的部署

    神经发育过程中

    .    肌凝蛋白10促进神经元细胞素的形成

    SHH和WNT运输

    .    细胞素功能障碍会影响神经元细胞的命运

    规格

    细胞素信号提供了必要的信号

    对哺乳动物组织模式的贡献

    埃里克T。过道1米里亚姆E。迪拉德1伊丽莎白·r·克莱弗顿1张燕1克里斯蒂娜·戴利,1Shariq S.安萨里,1

    兰德尔韦克菲尔德,2丹尼尔·斯图尔特,1Shondra。普鲁特米勒,1,3阿方索拉瓦多,1,4亚历克斯·卡里西,1

    阿曼达约翰逊,2永东王1艾玛塞尔纳,1迈克尔塔内斯,5杨桑雨,5卡门辛德·罗宾逊,2

    杰弗里斯坦伯格,5还有斯泰西·k·奥格登1,6,*

    1美国孟菲斯市圣犹大儿童研究医院细胞和分子生物学系,TN 38105

    2细胞成像共享资源,圣犹大儿童研究医院,孟菲斯,TN 38105,美国

    3高级基因组工程中心,圣犹大儿童研究医院,孟菲斯,TN 38105,美国

    4圣犹大儿童研究医院儿童神经系统疾病研究中心,孟菲斯,TN 38105,美国

    5体内成像和治疗中心,圣犹大儿童研究医院,孟菲斯,TN 38105,美国

    6引线接触

    *Correspondence: stacey.ogden@stjude.org

    https://doi.org/10.1016/j.单元.2023.12.003

    总结

    在发育过程中,形态因子通过指示细胞的命运来塑造组织。无法直接可视化形态转运,因此确保形态成功传递的分子机制仍不清楚。为了解决这个长期存在的问题,我们开发了一个受损的声音刺猬(SHH)形态发生传递的小鼠模型,并发现内吞循环促进SHH加载到被称为细胞素的信号丝状伪足中。我们优化了保存体内细胞素的方法,用于先进的显微镜观察,并显示内源性SHH定位于小鼠神经管发育过程中的细胞素。从神经管中消耗SHH会改变神经元细胞的命运并损害神经发育。丝状状体运动肌球蛋白10(MYO10)的突变降低了细胞素的长度和密度,从而破坏了SHH和WNT的神经元信号活性。这些结果表明,基于细胞素的信号转运为哺乳动物组织发育过程中的形态发生分散提供了重要贡献,并表明MYO10是细胞素功能的关键调控因子。

    介绍

    发育模式依赖于协调的细胞命运决定,这些决定由被称为形态因子的信号蛋白指导。形态因子以时间和浓度依赖的方式发挥作用,通过信号梯度诱导不同的细胞命运,从而形成复杂的器官和组织。1,2这些梯度的改变会导致发育障碍和癌症,这强调了在发育和组织稳态过程中精确控制形态发生者的分布的必要性。3

    提出的形态发生子如何达到其目标的模型包括自由和辅助扩散,胞吞,以及通过称为细胞素的特殊丝状伪足直接传递。4实验证据支持每一个分散过程,但控制这些运输模式的分子机制尚未明确定义。在理解细胞素如何影响形态发生信号传导方面的知识差距仍然非常大,因为技术上的挑战往往阻碍了对体内结构的研究。

    细胞素是一种长、薄、动态的细胞延伸,可以促进直接传递声音刺猬(SHH)、WNT、骨形态发生蛋白(BMP)、生长因子和

    在发育和组织稳态过程中的NOTCH配体。5–7关于细胞素生物学的大部分了解都源于人们对它们对果蝇翅盘、气囊原基和卵母细胞组织和发育的贡献的研究。8–10关于细胞素在脊椎动物发育过程中的功能的证据相对有限,但使用斑马鱼、小鸡和美西螈模型的研究表明,细胞素影响原肠形成,并能促进四肢的发育和再生。11–13在脊椎动物神经管等复杂组织组织中询问细胞素仍然不可行,因此限制了对这些结构何时何地活跃以及它们是如何被调节的理解。

    为了深入了解这一重要的生物学特性,我们询问了SHH形态发生信号通路。3,14,15SHH具有两种共价脂质修饰,包括氨基端长链脂肪酸和羧基端胆固醇。这两者都是SHH信号梯度的建立所必需的,也有助于调节补丁(PTCH)受体。16–19SHH脂质赋予成熟配体高的膜结合倾向,需要专门的机制来中和脂质系结,以便从产生的细胞中部署。这一机制的一个重要组成部分是12通道跨膜蛋白


     

    细胞187,1-18,2024年1月18日,ª,2023年,作者。.    1这是一篇在CC BY-NC-ND许可(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).下的开放获取文章

    已发送(DISP)。20–24DISP使用质膜Na+梯度驱动SHH膜提取转移到细胞外扩散伴侣信号肽,CUB结构域和包含2的EGF样结构域(SCUBE2)。25–29奇怪的是,对小鼠的遗传学研究表明,SCUBE2在某些shh调控的发育过程中可能是需要的,30这表明存在独立的、冗余的或协作的部署机制。因此,刺猬配体可以定位到从外泌体中的信号细胞中释放出来的细胞素内的囊泡结构。31–36因为DISP定位于细胞素,36–38我们假设,除了促进SISP促进SCUBE2的辅助扩散外,还促进细胞素介导的SHH转运。控制细胞素中DISP活性的调控机制尚不清楚。

    我们之前证明了在DISP的第一个细胞外环中Furin的分裂是SHH部署所必需的。39结构分析显示,虽然二硫键在剪切后保留了裂解片段,但DISP的处理对于打开其胞外结构域以实现SHH的释放是必要的。28,29,40为了确定卵裂破坏如何影响SHH细胞素进入和形态梯度活性,我们建立了一个DISP加工受损的敲入小鼠模型(DISPCS).我们演示了DISPCS突变小鼠改变了神经模式、小脑功能障碍,以及由神经元细胞素的SHH消耗导致的高围产期死亡率。通过肌动蛋白运动肌凝蛋白10(MYO10)的丢失来破坏细胞素功能,从而获得了SHH信号通路的类似缺陷。36,41值得注意的是,有助于背侧神经管模式的WNT信号通路,同样因MYO10的丢失而减少。综上所述,我们的研究结果支持了细胞素在哺乳动物组织形态发生过程中发挥重要作用,并确定了MYO10是细胞素功能的调节因子。

     

     

    提示跳跃表型是Disp1中SHH信号减少的特异性表现CS/INDEL而不是由小脑功能障碍引起的一般共济失调。

    研究Disp1对组织模式的影响CS/INDEL通过SHH形态梯度,我们分析了E9.5/25-30体胚胎发育的神经管。开始…E8.0,来自脊索的SHH信号诱导神经管底板(FP),用叉头盒A2(FOXA2)标记。SHH还指定了不同的腹侧神经管祖细胞结构域,由NK2 Homeobox 2(NKX2.2)、少突胶质细胞转录因子2(OLIG2)和配对box 6(PAX6)标记。47这些腹侧细胞命运的诱导对SHH暴露的波动高度敏感,因此祖细胞结构域的建立可以作为SHH形态发生梯度活性的读数。48,49已发表的研究表明,具有杂合子Disp1突变的小鼠在表型上与野生型(WT)动物难以区分,而DISP活性的完全丧失会导致E9.5的死亡。21–23因此,演示1CS/+和显示器1印第安纳州/+胚胎表现为表型正常,具有典型的神经管祖细胞结构域建立(图2A-2C、2F-2H和2K-2N)。相反,显示器1英德尔缺乏功能性Disp1等位基因的突变体,在E9.5附近死亡,并出现神经管缺陷,包括PAX6的完全腹侧化和FOXA2、NKX2.2和OLIG2祖细胞结构域的丢失(图2D、2I和2K-2N)。显示器1CS/INDEL.   神经管保留了足够的SHH信号活性来诱导FP和NKX2.2和OLIG2祖结构域。然而,与对照组相比,这些结构域的大小缩小并向腹侧移动(图2J与图2F、2K-2Q、S2A和S2A相比0).因此,RNAscope原位杂交分析显示,在Disp1中表达Gli1的细胞数量减少CS/INDEL与对照组相比(图2R-2W、S2B和S2C)。RNA测序(RNA-seq)分析证实,Disp1中的神经元分化受到损害CS/INDEL胚胎(图S2D-S2G)。因此,在神经发育过程中,适当的SHH形态形成梯度活动需要适当的DISP裂解。

     

    结果

    DISP的分裂是神经发育所必需的

    CRISPR-Cas9用于生成Disp1基因细胞外环1中Furin切割位点突变的敲除小鼠(图S1A)。39这导致产生了目标突变等位基因(Disp1CS)和一个敲除基因功能的11个碱基对缺失突变体(Disp1英德尔,图S1A)。杂合子Disp1CS/+小鼠表型正常,而Disp1CS/CS突变体有不同的脑积水(图S1B和S1C)。因此,演示1CS可能作为一个畸形等位基因,降低但不减弱DISP活性。因此,通过结合Disp1,进一步减少了Disp1基因的剂量CS和显示器1英德尔反式的等位基因导致了高渗透率和严重的表型。大多数Disp1CS/INDEL幼崽在出生后1周内死亡,存活的动物会逃跑,无法茁壮成长(图1A-1C和S1D)。存活下来的磁盘1CS/INDEL小鼠表现为脑积水,颅骨大小缩小,眶间距离缩小,颌骨缩短,小脑体积减少(图1D-1F0和S1E-S1G0),表明在发育过程中SHH信号通路减少。42–44值得注意的是,97%的存活的Disp1CS/INDEL小鼠(n = 38/39)在6周龄时出现了跳跃性步态共济失调(图1G-1I0;视频S1)。跳跃步态可能是由于shh指定的神经祖细胞的消耗,45,46sug-

    DISP的内吞作用被分裂破坏而改变

    在果蝇中,从极化的上皮细胞中部署Hh需要disp介导的内化和内吞循环。37,50为了测试DISP是否在哺乳动物细胞中发生了再循环,我们开发了一个体外系统来询问DISP在极化、多细胞球状体中的运输。小鼠髓内收集管(IMCD3)细胞在3D培养中极化并可形成多细胞球状体,51用编码WT或CSV5-disp-血凝素(HA)蛋白和强力霉素诱导的SHH的载体转导(图3A-3G、S3A和S3A0).IMCD3细胞在Matrigel中培养,促进其组织成具有根尖腔的球状体(图3A-3E)。V5和HA表位标签之间的信号重叠用于追踪未切割的DISPCS和处理DISP重量其二硫键栓在氨基末端。28,29无SHH,DISP重量本地化更基础,而DISPCS沿着细胞膜均匀分布(图3a0和3c0).在强力霉素诱导后,SHH在根尖腔和细胞膜上积累,以及DISP重量

    2细胞187,1-18,2024年1月18日


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    图1. DISP裂解中断引发发育缺陷

    (Aand B)男性和女性Disp1CS/INDEL小鼠体型缩小(n=5-17只小鼠/基因型)。P35雌性小鼠显示在(A).中

    (C) A Kaplan-Meier生存曲线显示Disp1的生存能力降低CS/INDEL老鼠从P0到P35,每周监测16窝。

    (D和E) Disp1CS/INDEL小鼠有脑积水和颅面缺陷。

    (E)Disp1的计算机断层扫描(CT)扫描CS/INDEL颅骨显示宽长比扩大,眶间间距减少,颌骨长度减少(n=10-12只小鼠/基因型)。

    (Fand F0) Disp1CS/INDEL小鼠的小脑也很小(方括号)。在P0、P22和P55时计算小脑体积相对于总脑体积。每种基因型至少分析4只小鼠。

    (G–I0) Disp1CS/INDEL老鼠的步态跳跃。(Hand I)前肢(蓝色)和后肢(红色)跟踪肢体位置和量化步态比率。计算5只小鼠/基因型的步态比例,并合并雄性和雌性数据。所有数据均以平均± SD,*p < 0.05,**p < 0.01,****p < 0.0001表示。请参见图S1和视频S1。

    沿着基底外侧膜均匀富集(图3b0、3F和3G)。磁盘CS在SHH诱导后,根尖基底分布没有变化(图3D0,3F和3G),表明Furin的切割启动了shh刺激的极化上皮细胞的膜再分配。

    为了确定shh刺激的DISP膜再分配发生的分子机制,我们在Disp1中稳定表达了V5-DISP-HA蛋白-/-分配)小鼠胚胎成纤维细胞(mef)。这就允许对DISP进行检查

    在没有内源性的背景下的膜运输

    可能影响DISP的DISP蛋白CS循环通过

    低聚物关联。39,52细胞表面生物素化和环素化

    己酰亚胺处理实验证实了DISP重量

    磁盘CS蛋白质具有相似的细胞表面表达和

    降解动力学,表明裂解破坏有

    不显著降低DISP蛋白的稳定性或限制其mem-

    膜访问(图S3B、S3C0和S3N)。探测SHH-

    诱导DISP膜循环的变化,我们进行了


     

    细胞187,1-18,2024年1月18日3


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    图2。DISP卵裂破坏改变了神经管模式

    (A-E)指示基因型的E9.5/27-29体细胞胚胎显示。

    (F-J)对E9.5/27-29体细胞胚胎发育中的神经管的心脏水平切片进行FP和腹侧祖细胞标记物的染色。DAPI标记核。星号表示FOXA2在脊索和前肠中的表达(I)。

     

    (下页继续图例)

    4细胞187,1-18,2024年1月18日


    免疫荧光共定位分析并计算DISP与内吞标记蛋白适配器蛋白2a(AP2)、网格蛋白、洞穴蛋白、Rab4、Rab5、Rab7和Rab11之间的Pearson相关系数(图3H和3H0).53而DISP重量和DISPCS在没有SHH的情况下,蛋白表现出与AP2相似的共定位水平,而SHH的表达存在差异。在表达SHH的细胞中,DISP重量与AP2的共定位增加,而DISP则增加CS-AP2的共定位保持不变(图3H0和S3D-S3G)。在DISP之间也观察到shh诱导的共定位增加重量以及网格蛋白、Rab4、Rab5、Rab7和Rab11(图3H0和S3H-S3M),表明DISP重量与SHH的相互作用增强了内吞循环。磁盘CS循环核内体的富集对配体的反应没有增加。然而,它比DISP略丰富重量在没有SHH的情况下,肠黄素、Rab5、Rab7和Rab11标记的内吞室(图3H0和S3H-S3M)。

    DISP与洞穴蛋白的共定位均未被切割位点突变或SHH的表达所改变,这表明网格蛋白介导的内吞作用是SHH刺激的DISP内吞循环的主要途径(图3H0).因此,我们在DISP的胞内羧基端尾部确定了AP2网格蛋白适配器复合物的四个推测的双亮氨酸结合基序(图3I)。为了确定这些基序是否有助于shh刺激的再循环,我们生成了一个缺失所有四个基序的羧基末端缺失突变体(DISPΔC)和一个将这四个基序突变为丙氨酸的突变体(DISP4xAA).两个DISPΔC和DISP4xAA到达细胞表面,并被Furin有效地处理,这可以通过细胞表面的生物素化和V5裂解片段的产生来证明(图S3N)。重要的是,ΔC和4xAA突变体在生物素化质膜组分中均表现出高于DISP的富集重量和DISPCS,与促进DISP内吞作用的ap2结合位点一致(图S3N)。磁盘ΔC质膜富集比DISP更明显4xAA,表明羧基末端片段中的一个额外的基序可能有助于膜的内化。因此,我们专注于DISPΔC为进一步分析。可能是由于在DISP之间观察到的基线共定位适度升高CS和内吞机制,DISPCS其细胞表面定位率低于DISP重量(图3H0和S3N)。

    为了进一步探索这一机制,我们检测了Furin的切割是否影响了DISP-AP2的结合。V5-DISP-HA蛋白在表达shh的Disp中表达我们进行了mef实验和共免疫共沉淀实验。与DISP通过网格蛋白/ap2依赖的机制内化相一致,a和β-适配蛋白蛋白均存在于与DISP的抗ha共免疫沉淀中重量(图3J,第5车道)。第2页

    在两个V5-DISP中的适配器亚基都减少了CS-HA和V5DISPΔC-HA共免疫沉淀(图3J,6-7通道),支持DISP通过一个或多个已鉴定的羧基末端结合基序结合sAP2,Furin切割在SHH结合后通过这些位点增强DISP-AP2的结合。

    来检测减少的AP2结合是否改变了DISPCS或DISPΔC内化动力学上,我们用光稳定荧光标记Dronpa3标记WT和突变体DISP蛋白54并追踪Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞的基线和shh刺激的内化。52,55为了准确地跟踪膜的内化,我们首先使用网格蛋白抑制剂Pitstop 2暂停内吞作用,56然后监测Pitstop 2洗脱前后的DISP-Dronpa3质膜信号强度(图3K-3L0).与网格蛋白是DISP内化的主要途径相一致的是,所有的DISP变体在Pitstop 2的作用下都在质膜上积累(图3K和3L)。Pitstop 2洗脱后,三种DISP蛋白的膜信号强度均下降,但它们的内化率差异明显(图3K0和3l0).根据在DISP之间观察到的适度升高的共定位CS而内吞标记物对SHH的反应没有改变(图3H0), DISPCS在配体缺失和存在的情况下,以恒定的速率内化。相反,SHH的表达加速了DISP重量内部化的速度比DISP更快CS(图3K0),进一步表明WT蛋白经历了配体刺激的内吞作用。磁盘ΔC内化的速度比DISP要慢重量在SHH的缺失和存在的情况下,证实了羧基端ap2结合基序是DISP有效内吞作用所必需的(图3L0).结合以上实验,这些结果表明,DISP膜的循环是通过网格蛋白介导的内吞作用发生的,而Furin的切割增强了DISP对SHH的反应,以及配体刺激的循环内吞作用(图3M)。

    DISP突变减少了SHH细胞素的进入

    对果蝇和脊椎动物的研究表明,Hh配体从外囊泡中产生的细胞中释放出来,我们实验室之前的工作表明,SHH和DISP定位于细胞素内的囊泡。31–33,35,36因此,我们推测DISP-SHH复合物的内吞循环可能促进SHH囊泡富集以促进细胞素进入。检测DISP的内吞循环活性CS改变了细胞素中SHH的数量,我们在Disp中稳定表达了WT或CS V5-DISPHA蛋白mef,然后定量细胞素发生率和SHH和DISP细胞素进入(图4)。我们之前证明了SHH共受体的兄弟


    (=-n)每个基因型分析的n3个3-5个胚胎的神经管切片中所示的祖细胞标记物的平均表达域区域(黑点)。灰色的点代表单独的部分。

    (O和P)以OLIG2 (O)和NKX2.2 (P)沿背侧/腹侧(DV)轴的平均荧光强度线图显示。从FP中线基面到屋顶的线形图(虚线,插入O)。虚线表示扫描电镜。n=14-18个切片。

    (Q)指示的DV位置相对于神经管长度的箱线图。腹侧和背侧区域的位置分别显示在盒子的顶部和底部。n = 3个胚胎,每个胚胎有5-8个切片。FP中线被设置为零。

    (R-V)RNAScopeGli1原位杂交在E9.5/25-30体细胞期匹配的心脏水平的神经管切片上。Gli1探针为红色,DAPI为蓝色。

    (W)从FP到屋顶板的平均Gli1信号强度图。每个基因型有3个胚胎,每个基因型定量n个=26-30个切片。虚线表示半散点,箱线图数据表示为平均± SD,**p < 0.01,****<0.01,****p < 0.0001,ns =不显著,见图S2。. .

     

    细胞187,1-18,2024年1月18日5


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    图3。DISP的裂解促进了shh刺激的内吞循环

    (A–D0) IMCD3球状体稳定表达DISP重量或DISPCS蛋白质用抗v5(洋红色)和抗ha(绿色)进行免疫染色。F-actin在(A)和(C)中为黄色(强力霉素阴性),强力霉素诱导的SHH在(B)和(D).中为黄色DAPI是蓝色的。缩放区域用虚线表示。箭头表示(F)和(G)分析的区域。

    (下页继续图例)

    6细胞187,1-18,2024年1月18日


     

    CDON(BOC)和细胞粘附分子相关/被致癌基因(CDON下调)促进shh产生细胞中细胞素的发生,而在培养的小鼠成纤维细胞中细胞素的形成不需要DISP。36因此,SHH的表达增加了细胞素的发生率,而不依赖于DISP(图4A)。尽管它能够促进Disp中细胞素的发生SHH不能有效地进入缺乏DISP蛋白的细胞素,也不能激活与SHHDisp共培养的SHH光II胶荧光素酶报告细胞的信号mef(图4B、4E和S3O)。DISP蛋白在DISP中的表达mef显示DISP重量和DISPCS以相似的效率进入细胞素。尽管如此,只有DISP重量显著增加SHH细胞素进入,尽管水平略低于WT细胞中观察到的水平(图4B-4G0).类似地,DISP重量在SHH光II细胞共培养实验中,SHH产生细胞中表达比DISP表现出更高的信号活性CS(图S3O)。因此,配体刺激的DISP-SHH复合物的内吞循环可能有助于SHH包装成囊泡,用于细胞素装载和/或信号转导。

    进一步评估SHH细胞素进入DISP的影响CS在接收细胞(RCs)中表达通路诱导的信号产生细胞,我们监测了shh激活的Ca2+不断的变动36分配单独表达SHH或与WT或CS DISP蛋白共同表达的mef与Ca共培养2+在细胞素接触的报告细胞中定量报告细胞和通量率。加拿大2+通量率与SHH细胞素加载状态相关,如DISP重量-表达细胞诱导的通量率明显高于Disp或DISPCS表达细胞(图4H)。因此,DISPCS突变破坏了shh刺激的DISP内吞循环,减弱了其伴随SHH进入细胞素的能力,从而促进接触介导的信号传导。

     

    含shh的细胞膜存在于

    神经管

    我们开发了组织处理、固定和成像策略,以便在发育中保存和检测细胞素。57使用这些方法,我们从产生shh的NCs和神经管FPs中寻找细胞素样延伸。一种番茄膜

    使用brane-GFP(mT/mG)报告基因用GFP标记表达shh的细胞膜。58,59共聚焦显微镜观察E9.5/25-30体胚胎的心脏水平切片显示GFP阳性膜延伸从FP细胞向邻近的非GFP表达的细胞延伸。在分析的88%的组织切片中观察到这些延伸(图5A,箭头)。GFP阳性的FP延伸也穿过神经管腔(NTL),接触邻近的非GFP标记细胞(图5B和5B0).平均,……观察到11个管腔延伸,表明发育中的神经管中产生shh的细胞可以直接接触靶细胞群。

    为了确定神经管延伸是否为细胞素,我们检测了SHH和肌动蛋白的定位。我们使用Shh在神经管切片中验证了抗Shh抗体染色GFP从内源性SHH启动子中产生一个内部gfp标记的、脂质修饰的SHH蛋白的敲入等位基因。60什赫+/+, ShhGFP/+, ShhGFP/GFP胚胎用抗GFP和抗shh染色,然后用共聚焦显微镜分析。而Shh+/+胚胎中抗GFP和抗Shh信号之间的共定位可以忽略不计,NC和FP的信号重叠随着Shh的增加而增加GFP等位基因合子性(图S4A-S4C)。由于SHH抗体在固定组织样本中检测SHH蛋白具有足够的敏感性,我们通过WT胚胎的全贴装免疫染色检测fp衍生的延伸是否包含内源性SHH和actin(图5C)。检测到含有SHH斑点的肌动蛋白阳性延伸从FP延伸到NTL,表明在Shh-Cre;Rosa26的NTL中观察到GFP标记的膜延伸mT/mG胚胎很可能是细胞素(图5B-5C0).

    为了研究神经管细胞素的运动轨迹,采用扫描电镜(SEM)进行双向观察切片E9.5 Disp1+/+, Disp1印第安纳州/+和Disp1英德尔em-通过处理来暴露NC、FP和NTL内衬细胞的顶端表面(图5D和S4D)。在对照组和Disp1中,观察到长而薄的细胞延伸穿过腔内细胞的顶端膜,并接触相邻细胞的顶端初级纤毛英德尔


    (E)IMCD3球体模型显示了(F)中的分布曲线和顶端/基础荧光强度比(G)的分析区域。

    (F)显示了V5-DISP-HA从基底膜到根尖膜的平均荧光强度分布曲线。数据归一化为平均分布强度等于1,点代表细胞±SEM(n=21-29个细胞)分布的平均强度。实线表示整个细胞内荧光强度的综合曲线。

    (G)DISP中HA、V5和SHH的平均荧光强度比±SD(根尖/基础)重量或DISPCS显示表达球形细胞(每个条件下n=40-47个细胞)。

    (H)网格蛋白和小泡蛋白内吞途径的汇总图。

    (H0)DISP-HA与Disp中内吞体标记物共定位的皮尔逊相关系数值稳定表达V5-DISP的mef重量-HA或V5-DISPCS-HA在SHH-mCherry(n=23-39细胞)或空载体对照(n=60-126细胞)的存在下。数据以带有1的中位数(实线)表示st和3rd四分位数(虚线)。

    (I)V5-DISP-HA蛋白的示意图,其候选双亮氨酸ap2结合基序和羧基末端缺失消除了这些位点。

    (J)从Disp的膜组分中提取DISP-HA的免疫共沉淀mef稳定表达SHH与V5-DISP-HA蛋白稳定表达SHH或网格蛋白适配器亚基的GFP对照蛋白印迹。

    (K–L0)在Pitstop 2(K和L)和洗脱后的MDCK细胞单层中表达的DISP-Dronpa3蛋白(K0和L0).细胞共同表达膜-mCherry(对照)或SHH-mCherry。n=-3次实验,每个条件下分析31-54个细胞。数据以平均± 95%置信区间表示。

    (M)一个用于DISP内部化的模型。通过Furin裂解DISP促进shh诱导的构象转移,从而增强DISP-AP2结合网格蛋白介导的SHH-DISP复合物的内吞作用。裂解破坏改变了DISP的构象,以提高基础内化和减弱shh刺激的内化。在所有实验中,**<0.05,***p<0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001,ns =无显著性。见图S3。

     

    细胞187,1-18,2024年1月18日7

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    图4。DISP的裂解促进了SHH细胞素的进入和信号转导

    显示(A)细胞素发生率mef通过GFP对照(浅灰色)或SHH-GFP(深灰色)稳定表达指示的DISP蛋白。(B-D)Disp的共焦图像表达SHH-GFP的mef(绿色),稳定表达V5-DISP重量-HA (C,洋红色)或V5-DISPCS-HA (D,洋红色)如图所示。缩放图像显示了在上面的面板上概述的区域。

    (E和F)散点图显示了平均SHH-GFP (E)或DISP (F)细胞素/细胞体信号强度比值。

    (G和G0)V5-DISP中每个细胞素的SHH-GFP与DISP-HA的相对强度的线性回归模型重量-HA或V5-DISPCS-HA表达Dispmef。

    (H) NIH-3T3细胞表达R-GECO Ca2+报告基因与对照或表达Disp的Disp共培养细胞显示。从n个=31-41个与产生SHH-GFP的细胞素接触的单个细胞中计算每分钟的通量率控制或DISP重量/DISPCS表达mef。数据以平均±标准差表示。对于所有图表,显著性表示为**<0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001,ns =不显著。

     

    胚胎(图5E-5H)。大约50%的根尖初级纤毛通过独立于DISP状态的延伸进行接触,表明这些关联具有功能意义(图5H和5I)。虽然大多数细胞连接与NTL细胞的顶端膜接触,但也观察到连接提示了与果蝇类似的形态发生突触61(图5F,绿色圆圈)。由于神经管的复杂结构,很难识别大多数延伸的起源。然而,在细胞-细胞接触的部位,延伸经常出现进入管腔(图S4E,绿色箭头)。因此,来自腹侧FP细胞的延伸可以被追踪到NTL,这表明它们可能在细胞-细胞连接之间传递(图S4F和S4G,绿色箭头)。与体外实验表明DISP不需要细胞素形成一致,在所有检测的基因型中,神经管延伸具有相似的顶端暴露长度和发生率(图5G和S4H)。值得注意的是,所有基因型的细胞延伸都显示出沿其长度的突起

     

    代表囊泡性货物(图S4F和S4G,黄色箭头),如之前报道的果蝇和小鼠细胞培养。36,62

    基于细胞素的根尖SHH传递

    初级纤毛作为信号枢纽,富含SHH通路成分,包括受体PTCH、信号传感器平滑(SMO)和胶质瘤相关癌基因(GLI)转录效应因子。63,64因此,SHH顶端细胞向初级纤毛是一种快速激活通路的有效机制。因为腹侧神经管祖细胞结构域的SHH规范发生在E8.5–E9.0/8-20体细胞之间,47用共聚焦显微镜观察17-20体期的WT胚胎,以检测NTL内衬细胞的初级纤毛附近的SHH。我们在管腔内观察到SHH,它经常与arl13b标记的初级纤毛共定位(图5J,箭头)。值得注意的是,在相邻细胞群中,46%(n = 39/84)的肌动蛋白阳性延伸与arl13b标记的顶端初级纤毛接触,其中含有SHH(图5K-5K00和S4I-S4J00;视频S2和S3)。这些


     

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    图5。SHH定位于发育中的神经管中的细胞素

    (A–B0神经管显示E9.5/25-30 E9.5/25-Rosa26mT/mG晶胚在17个胚胎的69/78切片扫描中检测到来自表达shh细胞的(A)GFP标记细胞延伸。(波段B0)GFP阳性膜延伸从FP穿过神经管腔接触邻近细胞(插图显示缩小)。

    (C–C0)一个3D渲染显示了从一个Disp1的神经管FP的延伸+/+E9.5胚胎F-actin染色(C阴影,C白色0)和抗shh(白色,箭头在C,洋红色为C0).图中呈现的区域由神经管示意图中的虚线框表示。每个组织切片平均观察到11个神经管腔延伸,如(B)和(C)。n = 976个扩展得分横跨32个胚胎。

    (D)矢状平分胚胎示意图,显示神经管腔(NTL)、FP和脊索(NC)根尖部的表面位置。

    (EandF)E9.5(E)Disp1的SEM图像印第安纳州/+(F) Disp1英德尔NTL。顶端延伸(洋红色)接触初级纤毛(箭头,蓝色)或使细胞尖接触(虚线圈)。

    (G)NTL顶端延伸段长度的散点图。每个基因型检测3个胚胎。共61个(Disp1印第安纳州/+)和68(演示1英德尔)扩展被测量。

    (H)每次扫描中观察到的接触细胞延伸的纤毛的百分比。用n = 344 Disp1对每个基因型进行4-11次扫描分析+/+, n = 684 Disp1印第安纳州/+,和n = 756 Disp1英德尔纤毛接触者得分。Ns,不重要。

    (H0)小提琴图显示了所有基因型中与初级纤毛接触和与初级纤毛接触的纤毛的比例。n=1784个初级纤毛和总延长39070分。数据以带有1的中位数(实线)表示st和3rd四分位数(虚线)。

    (一)纤毛与延伸接触处的代表性图像。接触延伸的纤毛呈粉红色,不接触延伸的纤毛呈蓝色。

    (J) E9.0/17–20 somite Disp1+/+神经管免疫染色为ARL13B(绿色)和SHH(洋红色)。箭头表示在初级纤毛附近的SHH斑点。n = 10个胚胎。

     

     

    (下页继续图例)

    第187,1-18号细胞,2024 9年1月18日

    结果与之前的报告显示SHH一致,60这表明细胞素可以直接将SHH传递给纤毛PTCH受体。

    为了检测FP内表达SHH的细胞的细胞素样延伸是否可以进入神经管将SHH传递到根尖腔,我们对对照和DISP突变E9.5胚胎的神经管进行了一系列阻断faceSEM(SBFSEM)(图5L、5M和S4K-S4M)。在所有基因型的测试中,单个片段的细胞之间存在多个膜性“水泡”(图5L,S4K0和S4L0).当通过连续扫描映射生成体积三维重建时,气泡连接起来,显示出指向管腔的长时间连续延伸(图5M和S4M;视频S4)。虽然FP中的高细胞密度阻止了我们将这些延伸映射到管腔内,但在矢状神经管切片的共聚焦和扫描电镜图像中观察到的细胞素的大小和轨迹相似,表明它们是相似的结构(图5A-5C0箭头、S4F和S4G黑色箭头)。因此,我们建议细胞素穿过腹侧神经管,以促进SHH传递到根尖腔。

     

    DISP增加了SHH进入神经元细胞素

    来自NC的SHH对于FP的诱导、向体细胞传递信号以及周围间充质的组织至关重要。65–69因此,NC和周围组织的扫描电镜显示,在对照组和DISP突变体胚胎中,NC、FP和间充质细胞的膜延伸之间存在相互作用(图6A、6C-6E、S5A和S5B;视频S5)。E8.5 Shh-Cre的共聚焦成像;Rosa26mT/mG和E9.5 ShhGFP/+胚胎证实了其延伸为SHH、F-actin和GFP阳性,表明它们是细胞素(图6B-6B00和S5C-S5C”)。值得注意的是,E8.5 Shh-Cre;罗莎26mT/mG胚胎显示GFP标记的NC延伸到shh反应的体69(图S5C-S5C)。这些结果表明,扩展可能促进NC和周围细胞群之间的通信。

    为了确定SHH定位到nc衍生的细胞素是否需要DISP,SHHGFP引入对照和Disp1突变背景,用共聚焦显微镜检测NC到FP的连接。在所有检测的基因型中,从NC到FP和间充质的多个f放线阳性延伸(图S5D-S5G)。值得注意的是,SHH存在于对照组胚胎的NC、FP和间充质之间的细胞素中,但在Disp1的细胞素中耗尽英德尔和显示器1CS/INDEL胚胎(图6F-6L)。我们量化了每个nc衍生的细胞中SHH斑点的数量E9.5 Disp1中的线束印第安纳州/+, Disp1英德尔和Disp1CS/INDEL胚胎同时使用手动和自动化的方法。我们发现,DISP突变基因型的细胞膜中SHH斑点明显少于对照胚胎细胞素(图6J-6L、S5H和S5I)。与这些连接相一致的是必要的-

     

    通过nc衍生的SHH诱导FP信号转导,Disp1的FPs中SHH蛋白水平显著降低英德尔胚胎(图6H和6I)。在对照组和Disp1中沿FP细胞基膜检测到脊索来源的SHH英德尔突变胚胎,表明当细胞素基运输受损时,基础信号仍然可以积累(图6H和6I,箭头)。尽管有这种积累,但在缺乏DISP活性的胚胎中,在FP中没有检测到SHH,这表明基础膜配体的积累不足以强大地诱导高阈值靶基因。基于我们的体外和体内结果,我们提出DISP促进SHH的内吞循环,将配体加载到细胞素中,进行顶端形态传递,这有助于神经管模式(图6M)。

     

    MYO10促进细胞素信号传导

    肌动蛋白运动MYO10促进丝状蛋白的形成,我们的体外研究表明,它有助于培养细胞中细胞素介导的shh运输。36,41,70因此,我们之前证明了MYO10在体内的缺失会破坏发育中的神经管中的SHH信号。36为了探究这种表型是否源于细胞素形成的改变,我们使用了我们的细胞素优化的组织处理方案来可视化Myo10中的细胞素m1J/m1J老鼠71我们首先分析了E8.5胚胎,其中SHH在NC中的表达明显高于在FP中。60在这一阶段,膜GFP(memGFP)信号被限制在E8.5 Shh-Cre;Rosa26mTmG胚胎(图7A,7B0,7E和7F)。虽然在对照胚胎的NC上可见大量的延伸,但在Myo10的NC上检测到的延伸很少m1J/m1J胚胎(图7a-7b0),表明肌动蛋白运动在其形成过程中的作用。

    量化对照组和Myo10中神经管延伸的长度和发生率m1J/m1J利用猫女软件对E9.5胚胎的SBF-SEM数据集进行了注释。72这表明Myo10m1J/m1J与对照组相比,神经管的延伸更少,现有延伸的平均长度相对较短(图7C、7D和S6A-S6E;视频S6)。这种缺失与Olig2表达模式的改变相关,从Myo10的完全缺失到Olig2明显的腹侧移位m1J/m1JE8.5/10-13个体细胞胚胎(图7A0对抗7B0和7e-7g)。这种转变表明了高水平SHH信号通路的减少,这通常限制了Olig2从直接邻近FP的细胞中发出。47,73在Disp1中也观察到类似的Olig2表达模式的改变CS/INDEL在E8.5/10-13体细胞上的胚胎,支持了类似的功能缺陷是由降低细胞素密度(Myo10m1J/m1J)或消耗其SHH(Disp1CS/INDEL)(图S6F-S6H)。这与myo10促进的细胞素在腹侧细胞命运决定的早期阶段促进SHH运输相一致,


    (K–K00)一个Disp1的三维渲染+/+腹侧神经管有两个方向。一个来自FP的F-actin(白色)标记的延伸(黄色箭头)和SHH(洋红色)与接收细胞(RC,蓝色箭头)标记的ARL13B(绿色)接触。黄色虚线表示FP和RC的划分。所渲染的区域由虚线框表示。

    (L)E9.5Disp1的单个SBF-SEM部分+/+神经管FP显示细胞间间隙,包含孤立的水泡(蓝色,inseti)和部分延伸(插图ii)。(M)三维重建的两个细胞的膜延伸。散点图用平均±标准差表示。请参见图S4和视频S3和S4。

     

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    E8.5 Myo10的NTL耗尽了SHH信号m1J/m1J胚胎(图7e00与图7F相比00,7H和7I)。因此,我们认为MYO10是体内细胞素功能和SHH信号通路的重要调节因子。

    在背侧神经管模式形成过程中,WNT和bmp在顶板上产生信号,与NC和fp衍生的SHH相反。74–76与之前的报道一致,即WNT和BMP家族成员都沿着细胞素运输,13,77我们观察到肌动蛋白阳性延伸从顶板延伸到背侧NTL(图S6I)。为了探究背侧细胞素是否有助于WNT和/或BMP在神经管中的运输,我们首先进行了体外细胞素发生试验,以确定MYO10是否影响WNT或BMP细胞素的形成。我们量化了对照组和Myo10中的细胞素发生率-/-在没有或存在SHH-GFP、BMP2-GFP、bmp4-橙色荧光蛋白(OFP)、BMP7-GFP和WNT1-GFP时的mef。36而BMP2、BMP4或BMP7荧光蛋白的表达并没有显著改变细胞素的发生率,而SHH-GFP和WNT1-GFP在WTmef中均有所增加,其发生率具有统计学意义(图S6J,浅灰色)。SHH-GFP和WNT1GFP均未增加Myo10中细胞素的发生-/-除了促进SHH细胞素的形成外,MYO10也是WNT细胞素形成的调节因子(图S6J,深灰色)。

    评估MYO10缺失对体内、对照组和MYO10神经管WNT信号的影响m1J/m1J检测E9.5/25-30体细胞胚胎,以评估WNT靶点Olig3的表达。MYO10缺失降低了OLIG3的背侧表达域(图7J-7M)。与体外实验结果一致,MYO10的缺失不影响bmp表达细胞的细胞素,bmp诱导的磷酸化SMAD(pSMAD)的背侧富集不受影响m1J/m1J神经管(图7N-7Q和S6J)。值得注意的是,E8.5 Myo10的RNA-seq分析+/+和Myo10m1J/m1J胚胎实验结果显示,在MYO10缺失后,SHH和WNT通路均被减弱,而BMP信号通路没有明显改变(图S7)。有趣的是,NOTCH信号可以通过环境依赖的细胞素运输发生,7在Myo10中也被确定为减少了吗m1J/m1J胚胎(图S7D和S7D00).综上所述,这些结果表明

     

    MYO10是细胞素功能的一般调节因子,除了基于扩散的信号分散机制外,基于细胞素的转运有助于WNT和SHH介导的神经管发育模式。

    讨论

    DISP的裂解促进了shh刺激的内吞作用

    再循环

    自从我们最初的报告强调了DISP裂解对SHH部署的重要性以来,多个DISP结构已经被解决。28,29,39,40,78结构证据表明,裂解片段仍然紧密相连,但剪切打开了DISP的胞外结构域,以适应SHH的结合。28,29,40,78我们新的细胞生物学实验表明,DISP的裂解增强了对shh刺激的ap2依赖的内吞循环的反应性。因此,我们认为DISP的切割稳定了一种蛋白质的构象,该构象转向“打开”的细胞内尾巴,以便在SHH结合时与AP2紧密结合(图3M)。我们推测Furin的裂解破坏改变了DISP的构象,使它与AP2以中间亲和力相互作用,以构成中层内吞循环。因为DISP的胞内结构域不能解决无脊椎动物的DISP低温电子显微镜(cryo-EM)结构,28,29,40我们不能明确地得出结论,SHH诱导构象变化,从而影响ap2结合位点。然而,细胞生物学分析揭示了DISP之间的一个关键的功能差异重量和DISPCS蛋白质是DISP的能力重量在信号产生的细胞中通过SHH进行增强的再循环。

    细胞素在神经管过程中运输形态因子

    图案装饰

    在小鼠中,nc衍生的dSHH信号到腹侧神经管,在E8.0左右开始指示腹侧命运。通过E9.5,Shh在FP中被诱导表达,FP在NC开始回归后作为神经管Shh的次要来源。60大多数腹侧命运是由E8.5确定的,这表明初始模式信息是通过nc衍生的信号传递的。60,66然而,脂质修饰的SHH从NC、后经FP、andintotheapicalneuraltubehaveremainedundefined.优化的组织处理和成像的发展


     

     

    图6。含shh的细胞素连接脊索、神经管FP和周围的间充质

    E9.5 Disp1的(A)扫描电镜印第安纳州/+胚胎显示脊索(NC)和间充质。nc衍生的延伸(洋红色)延伸到间充质细胞的延伸(蓝色)。

    (B–B00) E9.5 ShhGFP/+;Disp1印第安纳州/+胚胎染色为SHH(洋红)、f-actin(绿色)和DAPI(蓝色)。SHH点(B0在f-actin阳性(B00)在间充质和NC之间的延伸。顶部为FP,左侧为间充质细胞,右侧为NC。

    (C-E)单个NC细胞(蓝色)的三维体积渲染,与间充质细胞(黄色)的延伸接触延伸。同样的细胞会延伸到神经管FP的基面(D中显示的单个切片,E中显示的3D体积渲染)。参见图S5A和S5B和视频S5。

    (F–G0)对来自上述基因型的E9.5/27-29体细胞胚胎进行抗GFP(绿色)、抗shh(洋红色)和DAPI(蓝色)的免疫染色。在NC和FP (F0和G0,黄色箭头)。

    (H)来自NC(箭头)的抗Shh阳性延伸物接触到Shh中表达Shh的神经管FP边缘附近的细胞基底表面GFP/+; Disp1印第安纳州/+E9.5胚胎。

    (I)沿着a Shh的基面检测到SHH信号GFP/+;Disp1英德尔神经管(箭头),但FP中的信号减少。

    (Jand K)抗Shh斑点(洋红色,箭头)在Shh中NC和FP之间的F-actin阳性(绿色)延伸上GFP/+;Disp1印第安纳州/+胚胎(J)。在SHH中,NC和FP之间的连接中很少有明显的SHH斑点GFP/+;Disp1英德尔胚胎(K)。

    (L)对Shh的脊索-fp细胞素中平均抗Shh斑点面积的散点图GFP/+;Disp1印第安纳州/+, Disp1CS/INDEL和Disp1英德尔胚胎切片。每个基因型至少有2个胚胎,每个基因型有9-15个切片。数据以平均±标准差表示。**p <为0.01,ns,不显著。(M)内吞作用如何促进DISP-SHH进入细胞素的模型。WT和裂解缺陷的DISP蛋白都能进入细胞素,但只有WT的DISP能有效地将SHH转运到细胞素中。见图S5。

     

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    图7.肌球蛋白10促进体内细胞素形成和SHH和WNT信号传导

    (A–B0)腹侧神经管和深度阴影鼻弦延伸(箭头)从E8.5/10体SHH-Cre;Rosa26mT/mGMyo10+/+(A和A0)和Myo10m1J/m1J(B波段0. 胚胎的和弦是绿色的0)和(B0). (A0和B0)组织染色为OLIG2(黄色)、F-actin(洋红色)、anti-GFP(绿色)和DAPI(青色)。每个基因型分析n=4-6个胚胎。

    (CandD)散点图显示每个核(C)的延伸和延伸长度(D),从4个Myo10个体的E9.5神经管FPs的SBF-SEM中定量+/+和2 Myo10m1J/m1J每个胚胎有2个扫描序列。大的点/三角形代表个人扫描系列。小的标记表示各个部分。(E–F ") E8.5/14 somite SHH-Cre; Rosa26mT/mG(E) Myo10+/m1J和(F) Myo10m1J/m1J脊索和神经管切片,包括SHH(品红)、OLIG2(黄色)、F-actin(红色)、GFP(绿色)和DAPI(蓝色)。Myo10+/m1J胚胎表现出脊索来源的延伸(E0和神经管发光的发光斑点(E00,放大箭头)。

    (G)E8.5/10-15体细胞Myo10中正常、腹侧移位或OLIG2缺失的组织切片的比例+/m1J(n = 8)和Myo10m1J/m1J(n = 3)胚胎显示。每个胚胎分析3-6个切片,误差条= SD。

    (H和I)定量显示神经管腔内的SHH斑点(H)和穿过管腔根尖表面的SHH信号强度(I)。大的点/三角形代表单个的胚胎。半透明标记表示单个部分。在10-15个体细胞阶段,每个基因型有n=6-8个胚胎。

    (下页继续图例)

    细胞187,1-18,2024年1月18日13


    在观察小鼠胚胎组织中的长丝状伪足的方案,使我们能够验证细胞素参与了这种运输的假设。我们观察了NC和FP细胞素中的SHH,并提出了信号梯度建立过程中丝状导管的SHH(图7R)。与这一假设相一致的是,丝状肌动蛋白运动MYO10的丢失减少了NC和FP延伸的形成,并破坏了腹侧神经管中的SHH信号。值得注意的是,基因和RNA-seq数据表明,MYO10mutantshavereducedsignalingbyadditionalcytoneme货物蛋白WNT和NOTCH,提示MYO10在促进基于细胞素的形态发生运输中的一般作用。这种功能为Myo10的神经表型提供了一个潜在的解释m1J/m1J小鼠从SHH信号梯度的压缩到严重的外脑畸形,这可能是由于WNT通路活性的破坏。36,71,79

     

    细胞素有助于顶端SHH的传递

    尽管实验支持脊椎动物神经管中顶端SHH信号梯度,但刺猬信号是被极化上皮细胞接收的问题仍然是一个激烈争论的话题。32,35,37,50大多数在缺乏初级纤毛的果蝇翅盘上皮细胞上进行的研究表明,长程Hh信号在基础上积累。31,32,37在斑马鱼中,SHH积累在发育中的视杯细胞的基底膜上,细胞过表达SHH共受体CDON。80然而,在小鼠中,SHH仅在初始模式信息传递后的发育后期被检测到,并在信号-rcs的基底外侧膜上被诱导表达。60我们对神经管SHH分布的研究显示,在E8.5和E9.5胚胎中,FP细胞沿FP细胞基膜,但该信号不能有效诱导DISP突变体中的FP。这可能是因为,无脊椎动物,顶端初级纤毛是SHH通路控制的关键部位。81纤毛膜上的PTCH通过限制SMO激活甾醇的膜积累来调节纤毛SMO。82–85这使得PTCH的纤毛定位池成为SHH必须获得快速激活smo的必要部分。因此,我们倾向于在形态形成梯度建立过程中,SHH被神经上皮细胞在顶端接收以激活信号的模型。我们推测,在神经管成熟过程中,SHH的纤毛SMO积累有助于增强腹侧细胞的命运。这种强化可能是必要的,因为目标细胞对SHH梯度的反应在整个腹侧神经管模式中保持动态的。66

    我们预计,除了促进NC到FP的通信外,细胞素也促进了细胞素之间的通信

     

    NC和间充质形成椎间盘髓核。67,68因此,我们观察到nc衍生的含shh延伸接触邻近的间充质细胞并向体延伸。这些结果表明,细胞素从发育组织中心延伸出来,以促进与多个反应细胞群的同时通信,从而在早期发育过程中协调多组织模式。

     

    直接交付与扩散

    如果产生SHH的细胞使用细胞素将形态因子传递到反应细胞,扩散起什么作用,细胞外SHH伴侣SCUBE2的具体作用是什么?生化和遗传学研究表明,SCUBE2保护SHH脂质修饰从细胞外环境,以伴侣辅助扩散。26,27然而,在Scube2中,神经发育并没有被报道受到损害-/-老鼠30表明与其他SHH运输机制存在冗余。我们假设细胞素可能提供这种冗余和/或协同的转运功能,这是由这些不同的转运机制对DISP细胞内尾部的不同要求所表明的。结果表明,羧基末端尾部对于shh细胞循环和细胞素进入是不能缺少的。相反,已发表的研究表明,尾巴对于disp介导的SHH转移到SCUBE2是不可缺少的。28因此,在扩散和基于细胞素的转运过程之间可能会发生合作和/或代偿活动,以确保在发育过程中适当的信号分散。

     

    研究的局限性

    为本研究优化的成像方案代表了可视化发育组织中形态运输的重要技术进展。然而,由于组织深度、大小和神经管组织的技术限制,目前我们无法进行相关光电子显微镜或通过组织中的实时成像监测SHH从NC和神经管通过细胞素的运输。因此,我们还不知道体内细胞素是如何连接的,它们有多稳定,它们是否通过紧密连接获得顶端纤毛,它们追踪SHH信号梯度的距离,以及它们的长度是否与梯度步骤相关。未来的研究将集中于增强组织处理和蛋白质标记,以优化具有挑战性的成像实验,可用于生成发育胚胎的细胞素通信网络的高分辨率图。

    (J-Q)MYO10缺失会损害背侧神经管WNT信号通路。E9.5/25–30 somite Myo10+/m1J和Myo10m1J/m1J神经管切片染色为OLIG3(红色)(J和K)或pSMAD(红色)(N和O),用DAPI(蓝色)。

    (LandP)4个对照的平均表达域区域(2 Myo10+/+和2 Myo10+/m1J)和4 Myo10m1J/m1J体细胞阶段匹配的胚胎。大的点/三角形代表单个的胚胎。小的标记表示各个部分。所有散点图数据均以平均±标准差表示。

    (MandQ)OLIG3(M)和pSMAD (Q)沿背侧/腹侧(DV)轴的平均荧光强度线图显示。虚线表示SEM。n=21-25个基因型4个胚胎的25个切片。请参见图S6和图S7。

    (R)神经管中基于细胞素的信号传输模型。细胞素协助部署来自屋顶板的WNT(蓝色)和来自脊索和FP的SHH(绿色)。基于细胞素的转运可能与SCUBE2辅助的SHH扩散(品红色/绿色管腔复合物)和WNT的自由扩散(蓝点)合作,以完善或增强神经管发育过程中的形态发生信号梯度。

     

    14细胞187,1-18,2024年1月18日


    具体方法见本文在线版,包括:

    .  关键资源表

    .  资源可用性

    B铅接触

    B材料可用性

    B数据和代码的可用性

    .  实验模型和研究参与者的细节

    B小鼠

    B细胞系和培养条件

    .  方法详细信息

    B Disp小鼠生成

    B磁共振成像

    B计算机断层扫描

    B步态分析

    B神经管成像

    B小鼠胚胎中细胞素的保存和成像

    B细胞培养中细胞素的保存和分析

    BSHH斑点的分析

    脊索和神经管腔

    B RNA测序

    B细胞培养的免疫荧光和图像采集

    B图像处理与分析

    B质粒

    B蛋白稳定性环己酰亚胺测定法

    B免疫印迹和免疫共沉淀

    B球状体的生成与分析

    B共定位分析

    B DISP膜内化

    B荧光素酶报告分析

    B扫描电镜和定量

    .  B连续块面扫描电镜定量与统计分析

     

    补充信息

    补充信息可以在https://doi.org/10.1016/j.cell网站上找到。2023.12.003.

     

    确认

    蒂莫西·桑德斯和哈立德·凯毛里在图像采集和分析方面进行了咨询。马克·哈特利提供了对手稿的评论。rna测序是在SJCRH的哈特韦尔中心进行的。SBF-SEM数据传输由SJCRH的生物图像信息学中心(CBI)进行。圣城。Jude转基因核心(TCU)生成了Disp1突变体小鼠系。P.海滩和A。萨利克提供的Dispmef和发育研究杂交瘤库提供了抗体。资助项目:该研究由NIH R35GM122546(to S.K.O.)资助,F31HD110256(至C.A.D.),NCI P30CA021765(SJCRH癌症中心支持基金)和ALSAC的St。裘德儿童研究医院。该内容仅由作者负责,并不一定反映资助机构的观点。

    作者贡献

    概念化,E.T.H.,E.R.C.,M.E.D.,Y.Z.,和S.K.O.;方法论,E.T.H.,E.R.C.,M.E.D.,Y.Z.,R.W.,C.G.R.,C.A.D., S.M.P.-M., Y.-D.W.,D.P.S., E.S.,A.L.和J.S.;软件,E.T.H.,Y。-D.W.,和A.F.C.;验证,E.T.H.,E.R.C.,和D.P.S.;形式分析,E.T.H.,Y。Z., S.S.A., Y.-D.W.和J.S.;调查,E.T.H.,E.R.C.,M.E.D.,Y.Z.,R.W.,C.A.D., D.P.S., Y.-D.W.,M.T.,Y.S.R.,J.S.,E.S.,和A.J.;写作,E.T.H.,e.r.r.c.,M.E.D.,Y.Z.,C.G.R., S.M.P.-M., S.S.A., Y.-D.W.,J.S.,和S.K.O.;可视化,E.T.H.,E.R.C.,S.S.A.,和S.K.O.;监督,C.G.R.,S.M.P.-M.和S.K.O.;以及资金收购,S.K.O.

    利益声明

    作者声明没有任何相互竞争的利益。

    收稿日期:2022年7月26日

    修订日期:2023年9月6日

    接受时间:2023年12月1日

    出版:2024年1月2日

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    (2018).细胞分析器3.0:下一代生物学图像处理。PLoS生物体。16, e2005970.

    90.伯格,库特拉, D., 克罗格,特.,斯特拉勒,C.N.,考斯勒,B.X., Haubold, C., 希埃格,M.,艾尔斯,J.,贝尔,T.,鲁迪,M.,等人(2019)。.   .   用于(生物)图像分析的交互式机器学习。

    91.施耐德公司,C.M.,格哈德,S.,朗格尔,M.,卡兹米耶尔,T.,李,兹瓦尔特,M.F., A., 米德利,F.M.,费特,博士,萨尔菲尔德,等(2016)。果蝇连接组学的定量神经解剖学。eLife 5,e12059。

    92.康奈利,J.P.和普鲁特-米勒,S.M。(2019).短剑py:一个基于CRISPR的基因组编辑的多功能和高通量分析程序。科学。. Rep9, 1–8.

    93.萨布拉曼尼亚人, A., 塔马约,P.,穆塔,V.K.,慕克吉,S.,艾伯特,B.L.,吉列,艺术硕士,波洛维奇, A., 波莫罗伊,S.L.,Golub,T.R.,兰德,E.S.等。(2005).基因集合富集分析:一种基于知识的解释全基因组表达谱的方法。过程Natl。阿卡德斯奇。. 美国102,15545-15550。

    94.特马纳特,M.F.,彼得斯,弗洛里安,C.P.,康纳利,J.P.,和普鲁特米勒,S.M.。(2018).CRISPR-Cas9编辑《科学》杂志的验证策略调查。. 棱纹平布8, 888.

    95.郑,M.,卡尔基,R.,坎查拉纳,B.,伯恩斯,H.,普鲁特-米勒,S.M.,和坎尼甘提,T.D.。(2021).在革兰氏阴性细菌感染期间,Caspase-6促进caspase11-NLRP3炎症小体的激活。J.. . BiolChem297, 101379.

    96.布鲁克斯,S.P.,帕斯克,琼斯,邓尼特,S.B。(2004).作为转基因背景的近交系小鼠品系的行为特征。I:运动测试基因大脑Behav3,206-215。. .

     

    97.阿伯勒,梅赫塔,梅赫塔,凯尔,乔希,P.S.,弗鲁库斯,C.L.,哈丁,H. A.,施密茨,C.T.和Vezina,C.M. (2011).一种高通量原位杂交方法来表征胎鼠下泌尿生殖道中mRNA的表达模式。J.Vis。. Exp54, 2912.

    98.考夫曼,M.H。(1992).小鼠发育图集(爱思唯尔)。

    99.斯隆,T.F.W.,卡萨米,艺术硕士,容克, D., 叶姆,彼得·立大学,和查伦,F。(2015).shh和Netrin-1的浅层梯度的整合引导连合轴突。PLoS生物体。13, e1002119.

    100.霍尔,E.T.,和奥格登,S.K。(2018).通过改良的电子显微镜固定来保存培养的细胞细胞素。Bio Protoc.8, 8.

    101.马拉达,纳瓦罗,g., A., 斯图尔特D.P., Arensdorf,A.M.,纳克特盖尔,S.,安吉拉茨,E.,奥弗曼,J.T.,罗哈吉,R.,麦考密克,P.J.,等人(2015)。n-链糖基化在平滑信号转导中的作用的功能差异。PLoS基因。11, e1005473.

    102.奥格登,阿斯卡诺,斯特格曼,硕士,苏伯,L.M.,胡珀,J.E.,和罗宾斯,D.J. (2003).跨膜蛋白平滑与驱动蛋白相关蛋白Costal2之间的功能相互作用。柯尔。比奥尔。13, 1998–2003.

    103.佐佐木,H.,慧,C.C.,中福子,M.,孔藤,H。(1997).Gli蛋白的结合位点对于转基因中HNF-3底板增强子活性至关重要,并可在体外对Shh作出反应。发展124、1313-1322。

    104.陈,J.K.,泰帕尔,J.,库珀,M.K.,和比奇,P. A.。(2002).通过直接结合环巴胺来平滑来抑制刺猬信号通路。基因开发。16, 2743–2748.


     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    18号细胞187,1-18,2024年1月18日


    关键资源表

     

     

    试剂或资源

    标识符

    抗体

    鸡多克隆抗GFP

    鸟类

    Cat# GFP-1020; RRID: AB_10000240

    小鼠单克隆抗pax6

    DSHB

    Cat# pax6; RRID: AB_528427

    兔多克隆抗Olig2

    米利波尔

    Cat# AB9610; RRID: AB_570666

    兔多克隆抗foxa2

    阿布卡姆

    Cat# ab108422; RRID: AB_11157157

    兔多克隆抗nkx2.2

    诺夫斯

    Cat# NBP1-82554; RRID: AB_11005513

    小鼠单克隆抗shh(上清液)

    DSHB

    Cat# 5E1; RRID: AB_528466

    兔多克隆抗arl13b

    蛋白质技术

    Cat# 17711-1-AP; RRID: AB_2060867

    兔多克隆抗shH(H160)

    圣克鲁斯生物技术

    Cat# sc-9024; RRID: AB_2239216

    大鼠单克隆抗HA(克隆3F10)

    岩石

    Cat# 11867423001; RRID: AB_390918

    兔单克隆抗磷酸化-Smad1(Ser463/465)/Smad5(Ser463/465)/Smad9(Ser465/467)(D5B10)

    细胞信号技术

    Cat# 13820; RRID: AB_2493181

    兔单克隆抗OLIG3(JE56-40)

    塞莫费舍尔科学

    Cat# MA5-44904; RRID: AB_2931360

    小鼠单克隆抗V5标记(SV5-Pk1)

    (正式编号46-0705)

    塞莫费舍尔科学

    Cat# R960-25; RRID: AB_2556564

    小鼠单克隆抗rab5(E6N8S)

    细胞信号技术

    Cat# 46449; RRID: AB_2799303

    兔单克隆抗rab7(D95F2)

    细胞信号技术

    Cat# 9367; RRID: AB_1904103

    兔单克隆抗rab11(D4F5)

    细胞信号技术

    Cat# 5589; RRID: AB_10693925

    兔多克隆抗Rab4

    塞莫费舍尔科学

    Cat# PA3-912; RRID: AB_2269382

    兔单克隆抗Caveolin-1(D46G3)

    细胞信号技术

    Cat# 3267; RRID: AB_2275453

    兔单克隆抗网格蛋白重链(D3C6)

    细胞信号技术

    Cat# 4796; RRID: AB_10828486

    小鼠单克隆抗阿尔法自适应素

    塞莫费舍尔科学

    Cat# MA3-061; RRID: AB_2056321

    兔单克隆抗shh(C9C5)

    细胞信号技术

    Cat# 2207; RRID: AB_2188191

    兔单克隆抗kif5b

    阿布卡姆

    Cat# ab167429; RRID: AB_2715530

    小鼠单克隆抗微管蛋白(DM1A)

    细胞信号技术

    Cat# 3873; RRID: AB_1904178

    兔多克隆抗2适应蛋白

    贝谢尔

    Cat# A304-718A; RRID: AB_2620913

    山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 488

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-11029;RRID: AB_2534088

    山羊抗兔IgG(H+L)高交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 488

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-11034;RRID: AB_2576217

    山羊抗大鼠IgG(H+L)交叉吸附

    二抗,Alexa Fluorm 488

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-11006;RRID: AB_2534074

    山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 555

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-21424;RRID: AB_141780

    山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 555

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-21429;RRID: AB_2535850

    山羊抗大鼠IgG(H+L)交叉吸附二抗,Alexa荧光555

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-21434;RRID: AB_2535855

    山羊抗小鼠IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 647

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-21236;RRID: AB_2535805

    山羊抗兔IgG(H+L)高度交叉吸附的二抗,Alexa Fluorm 647

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-21245;RRID: AB_2535813

    AlexaFluor488-亲和纯F(ab‘)2片段

    驴抗鸡IgY(IgG)(H+L)

    杰克逊免疫研究实验室

    Cat# 703-546-155; RRID: AB_2340376

    AlexaFluor488-亲和纯F(ab‘)2片段

    驴抗大鼠IgG(H+L)

    杰克逊免疫研究实验室

    Cat# 712-546-150; RRID: AB_2340685

    (在下一页继续)

     

    细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e1


     

    继续

    试剂或资源

    标识符

    抗小鼠IgG(H+L),F(ab’)2片段

    (Alexa Fluor命647共轭)

    细胞信号技术

    Cat# 4410; RRID: AB_1904023

    抗小鼠IgG(H+L),F(ab’)2片段

    (Alexa Fluor 555共轭)

    细胞信号技术

     

    抗小鼠IgG(H+L),F(ab)2片段

    (Alexa Fluor 488共轭)

    细胞信号技术

    Cat# 4408; RRID: AB_10694704

    抗兔IgG(H+L),F(ab)2片段

    (Alexa Fluor 555共轭)

    细胞信号技术

    Cat# 4413; RRID: AB_10694110

    山羊抗兔IgG(H+L)交叉吸附

    二抗,Alexa Fluor似750

    塞莫费舍尔科学

    Cat# A-21039;RRID: AB_2535710

    过氧化物酶亲和纯驴子抗小鼠IgG(H+L)

    杰克逊免疫研究实验室

    Cat# 715-035-151; RRID: AB_2340771

    过氧化物酶亲和纯驴抗兔IgG(H+L)

    杰克逊免疫研究实验室

    Cat# 711-035-152; RRID: AB_10015282

     

    杰克逊免疫研究实验室

    Cat# 112-035-175; RRID: AB_2338140

    化学物质、多肽和重组蛋白

    组织-Plus似O.C.T.复合物

    塞莫费舍尔科学

    Cat# 23730571

    UltraPure似低熔点琼脂糖

    塞莫费舍尔科学

    Cat# 16520050

    ProLong似钻石抗褪色支架

    塞莫费舍尔科学

    Cat# P36961

    ProLong似玻璃防褪色支架

    塞莫费舍尔科学

    Cat# P36980

    ProLong似黄金抗褪色安装与DAPI

    塞莫费舍尔科学

    Cat# P36941

    氟蒙特-G似安装介质

    塞莫费舍尔科学

    Cat# 00-4958-02

    正常山羊血清

    杰克逊免疫研究实验室

    Cat# 005-000-121; RRID: AB_2336990

    HBSS,钙,镁,无苯酚红

    塞莫费舍尔科学

    Cat# 14025076

    杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水,10倍含钙和镁

    成粒

    Cat# 20-030-CV

    DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)

    塞莫费舍尔科学

    Cat# D3571

    ActinRed似555 ReadyProbes似试剂

    (罗丹明酚醛树脂)

    塞莫费舍尔科学

    Cat# R37112

    EZview似红色抗ha亲和凝胶

    微孔Sigma

    Cat# E6779

    Pitstop 2

    阿布卡姆

    Cat# ab120687

    Lipofectamine似3000转染试剂

    塞莫费舍尔科学

    Cat# L3000001

    次氯酸多西环素

    微孔Sigma

    Cat# D5207

    EZ-LinkSulfo-NHS生物素

    塞莫费舍尔科学

    Cat# 21217

    RNAscope似 ProbeMm-Gli1

    ACD

    Cat# 311001

    环己酰亚胺

    微孔Sigma

    Cat# 01810

    蛋白A/GPLUS-琼脂糖

    圣克鲁什

    Cat# sc-2003

    关键商业分析

    DIG RNA标记试剂盒(SP6/T7)

    岩石

    Cat# 11175025910

    ECL似是一个主要的西部印迹系统

    微孔Sigma

    Cat# GERPN2232

    RNAscope似多重荧光试剂

    套件v2

    ACD

    Cat# 323100

    RNeasy微型套件

    气根

    Cat# 74004

    TruSeq RNA文库准备试剂盒v2

    伊卢米纳

    Cat# RS-122-2001

    双荧光素酶报告基因检测系统

    Pro超级

    E1960

    存放数据

    批量Disp RNA序列

    这篇论文

    GEO: GSE242161

    Bulk Myo10 RNA序列

    这篇论文

    GEO: GSE242161

    实验模型:细胞系

    肌肉Mus:NIH3T3

    美国模式培养物保藏所

     

    小家鼠:神经-2a ATCC RRID: CVCL_0470

    (在下一页继续)

    e2细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


     

     


     

     

    继续

    试剂或资源

    标识符

    肌鼠:派遣KO(DispKO)MEF

    妈妈等等。22和图卡钦斯基塔尔。26

    N/A

    小家鼠: DispKO SHH MEF

    斯图尔特等人。39

    N/A

    小家鼠:MEF野生型

    指控。36

    N/A

    小家鼠:Myo10KOmef

    指控。36

    N/A

    Mus肌肉: IMCD-3

    美国模式培养物保藏所

    RRID: CVCL_0429

    MusMus:光II

    美国模式培养物保藏所

    RRID: CVCL_2721

     

    美国模式培养物保藏所

    RRID: CVCL_0422

    实验模型:生物体/菌株

    C57BL/6J(野生型)

    美国

    RRID: IMSR_JAX:000664

    B6.129(Cg)-Gt (ROSA)26

    索特姆4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J (mT/mG)

    美国

    RRID: IMSR_JAX:007676

    B6.Cg-Shhtm1(EGFP/cre)Cjt/J

    美国

    RRID: IMSR_JAX:005622

    B6.129X1(Cg)-Shhtm6Amc/J

    美国

    RRID: IMSR_JAX:008466

    B6.Cg-Myo10m1J/GrsrJ

    美国

    RRID: IMSR_JAX:024583

    C57BL/6-Disp1印第安纳州/+

    这篇论文

    N/A

    C57BL/6-Disp1CS/+

    这篇论文

    N/A

    寡核苷酸

    CRISPR-Cas9编辑结构(见表S1)

    这篇论文

    N/A

    DISP1编辑结构(见表S1)

    这篇论文

    N/A

    重组DNA

    pcDNA3.1(+)(对照载体)

    塞莫费舍尔科学

    Cat# V79020

    pCDNA3-EGFP

    由道格·戈伦博克赠送的礼物

    RRID: Addgene_13031

    pCMV-mCherry膜

    约斯特等人。86

    RRID: Addgene_55779

    pCMV-R-GECO1

    赵等人。87

    RRID: Addgene_32444

    pCMV-mCherry2

    这是迈克尔·戴维森送来的礼物

    RRID: Addgene_54517

    pCDNA3.1-mSHH-FL

    斯图尔特等人。39

    N/A

    pCDNA3.1-mSHH-FL-EGFP

    指控。36

    N/A

    pCDNA3.1-V5-DISPWT-HA

    斯图尔特等人。39

    RRID: Addgene_126410

    pCDNA3.1-V5-DISPCS-HA

    斯图尔特等人。39

    N/A

    pCDNA3.1-V5-DISPΔC-HA

    这篇论文

    N/A

    pCDNA3.1-V5-DISP4xAA-HA

    这篇论文

    N/A

    pCDNA3.1-V5-DISPWT-Dronpa3-HA

    这篇论文

    N/A

    pCDNA3.1-V5-DISPCS-Dronpa3-HA

    这篇论文

    N/A

    pCDNA3.1-DISP ΔC-Dronpa3-HA

    这篇论文

    N/A

    Dronpa3-N1

    这是迈克尔·戴维森送来的礼物

    RRID: Addgene__54682

    pLVX-Tet-On 3G

    塔卡拉

    Cat# 631187

    pCMV3-hBMP2-GFPSpark

    中国生物

    Cat# HG10426-ACG

    pCMV3-hBMP4-OFPSpark

    中国生物

    Cat# HG10609-ACR

    pCMV3-hBMP7-GFPSpark

    中国生物

    Cat# HG10083-ACG

    pCMV3-hWNT1-GFPSpark

    中国生物

    Cat# HG10721-ACG

    软件和算法

    斐济(ImageJ)(v2.9.0)

    辛德里尼塔尔。88RRID: SCR_002285

    http://fiji.sc

    CellProfiler (v4.2.5)

    麦奎内塔尔。89RRID: SCR_007358

    http://cellprofiler.org

    Ilastik (v1.4.0)

    贝尔盖塔尔。90RRID: SCR_015246

    http://ilastik.org/

    CATMAID (v2021.12.20)

    萨尔菲尔德等人。72

    施耐德-米泽尔等等。91

    RRID: SCR_006278

    http://catmaid.org/

    短剑py (v2.0)

    Connellyet al.92

    https://github.com/patrickc01/CRIS.py

    (在下一页继续)

     

     

    细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e3


     

     

    继续

    试剂或资源

    标识符

    徕卡应用程序套件X(LAS X)(v4.0.0)

    徕卡RRID: SCR_013673

    https://www.leica-microsystems。。com/ products/microscope-software/

    details/product/leica-las-x-ls/

    NIS元素(v5.41.02)

    尼康RRID: SCR_014329

    https://www.nikoninstruments。。com/ Products/Software

    图页棱镜(v8.0)

    GraphPad RRID: SCR_002798

    http://www.graphpad。。com/

    Amira(2020.3版)

    热费雪RRID: SCR_007353

    http://www.fei。。com/software/

    amira-3d生命科学/

    Inveon研究工作场所(v3.0)

    西门子

    投资公司-研究公司-工作场所。software.informer.com/

    分子签名数据库(GSEA)(v2023.1。

    苏布拉曼尼安等人。93RRID: SCR_016863

    http://software.broadinstitute.org/

    gsea/msigdb/index.jsp

    Photoshop(v24.3)

    Adobe RRID: SCR_014199

    https://www.adobe。。com/products/ photoshop.html

    插画家(v27.4.1)

    Adobe RRID: SCR_010279

    http://www.adobe。。com/products/

    illustrator.html

    首映式Pro(v15.4.1)

    Adobe RRID: SCR_021315

    https://www.adobe。。com/products/ premiere.html

    CLC基因组学服务器(v23.0.4)

    Qiagen RRID: SCR_017396

    https://www.qiagenbioinformatics.产品,基因组学,服务器

    Partek基因组学套件(v7.0)。RRID: SCR_011860 http://www.帕尔特克。com/?q=partekgs

     

    资源可用性

    引线接触

    进一步的资源和试剂的信息和要求应直接联系主要联系人Stacey Ogden(stacey.ogden@ stjude.org)。

    材料可用性

    根据完成机构材料转让协议,可提供本研究中产生的试剂。蛋白表达载体将存放在Addgene上。

    数据和代码可用性

    .大量RNA测序数据已存储在基因表达综合数据库中,并可在https://www上公开获得。关键资源表中列出的登录号GSE242161下的ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi。报告的所有数据

    在本文中,领导联系人将根据要求进行共享。

    .  本文没有报告原始代码。

    .  重新分析本工作文件中报告的数据所需的任何额外信息均可根据要求从领导联系人处获得。

     

    实验模型和研究参与者的细节

    小鼠

    本研究中的小鼠实验是在圣犹大儿童研究医院的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的方案下进行的(方案608-100616)。圣犹大机构动物护理和使用委员会根据《动物护理和使用指南》批准了所有程序。小鼠按照IACUC标准饲养在微隔离笼中,以减少病原体暴露。鼠标住房设施运行在一个12-12个自动照明系统上(12小时照明打开,12小时照明关闭),并带有一个独立的通风系统。小鼠被喂食标准食物和随意饮水。在这些研究中进行的分析显示,除了将动物体重分别按性别进行分析和与感兴趣的基因型进行比较外,性别之间没有差异。在我们的分析中,男性和女性的标本都是相同的。关于发育阶段和基因型的完整信息可以在图例、方法细节和关键资源表中找到。雌性小鼠的年龄在不同

     

     

    e4细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


     

     


     

     

    6-12周用于定时妊娠进行胚胎研究。从出生时开始,每周给新生儿称重。步态分析从2周龄开始进行到6个月龄,并有年龄和性别匹配的队列。

    细胞系和培养条件

    细胞在37岁时培养C在5%一氧化碳2在培养基中(DMEM或DMEM F12含有4.5g/LD-葡萄糖,[-]酚红,[-]L-谷氨酰胺,[-] HEPES,[-]丙酮酸钠,2mML-谷氨酰胺,1mM丙酮酸钠,1X非必需氨基酸,1%青霉素链霉素溶液(Gibco))。MDCK(NBL-2)、IMCD3(CRL-2123)、Shh Light II(CVCL_2721)和NIH3T3(CRL-1658)从ATCC公司中获得。显示器1-/-敲除(显示器) MEFs,22,26和迪斯普稳定表达SHH的mef在之前已经描述过。39Myo10重量和Myo10-/-来自男性胚胎的mef来源于以前的研究。36使用Flp-In系统(Thermo科学公司)开发了稳定表达感兴趣蛋白的克隆细胞系。pCDNA 5 FRT Disp重量或DispCS(V5/HA标记)和pOG44flp-重组酶载体被转染,并使用潮霉素进行筛选。稳定表达DISP的IMCD3细胞系重量或DISPCS(V5/HA标记)使用Flp-In系统生成,创建LacZ-FRT单克隆,然后创建pCDNA5FRTDISP重量或DISPCS(V5/HA标记)转染并使用潮霉素进行筛选。使用pLVX-Tet-On 3G系统(Takara Bio),用dox诱导的SHH病毒感染Flp-In mIMCD3s,其病毒MOI为2。在抗杀虫素选择后,细胞保持在G418中以保持稳定的整合。所有细胞系均通过功能分析和免疫印迹法进行常规验证,并每月用真菌警报(龙沙)检测支原体污染。根据制造商的说明,用脂质体3000和P3000试剂(赛默飞世尔科学公司)转染质粒DNA进行瞬时蛋白表达。当需要时,通过添加对照载体DNA,使用于转染的DNA的最终摩尔量保持不变。

    方法详细信息

    Disp小鼠生成

    演示1英德尔(-11bp)和Disp1CS使用CRISPR-Cas9技术和直接受精卵注射建立突变小鼠模型。sgRNAs被设计为与小鼠基因组中的任何其他位点至少有3个碱基对(bp)的错配,并在所需的修饰位点的50 bp范围内结合。在胚胎注射前,检测两种化学修饰的sgRNAs(Synthego)在稳定表达Cas9的小鼠neuro2a细胞(ATCC)中的活性,并通过靶向下一代测序(NGS)进行检测,如前所述(DOI: 10.1038/s41598-018-19441-8)。94所得到的NGS数据使用CRIS进行分析。py (DOI: 10.1038/s41598-019-40896-w).92裂解活性最高的sgRNA(SNP5。DISP1.g15)用于受精卵注射。将一个ssODN供体(10ng/ul,IDT)与Cas9 mRNA(10ng/ul,TriLink)和SNP5共注射。DISP1.g15(5ng/ul),用于创建Disp1CS小鼠模型ssODN设计为60 bp的同源臂278AAA突变,以及一个沉默的阻断修改,以防止在一个成功的整合事件后的重新切割。演示1英德尔小鼠模型是由SNP5裂解后的非同源端连接事件产生的双产物。DISP1.g15.注射受精卵并转移到0.5 dpc的假孕胎儿(7-10周龄的雌性与输精管切除的雄性交配)。95编辑结构及相关引物见表S1。在正确修改的创始人动物被确认后,小鼠被回交四代。

    磁共振成像

    磁共振成像(MRI)是在Bruker Clinscan 7T MRI系统(Bruker Biospin MRI有限公司,埃特林根,德国)上进行的。扫描前,小鼠在一个腔室中麻醉(3%异氟烷氧气1 L/min),并使用鼻锥输送(1-2%异氟烷氧气1 L/min)维持。为动物提供热支持,使用一个带有温水循环的加热床和一个生理监测系统来监测呼吸率。MRI采集在小鼠头部上方放置小鼠脑容量线圈,并放置在72 mm的发射/接收线圈内。定位器完成后,在水平(TR/TE = 3080/40 ms,矩阵大小= 256 x 256,视野= 36 mmx 36 mm,切片厚度= 0.5毫米,切片数= 20),冠状(TR/TE=/60/42 ms,矩阵大小= 192 x 192,视野= 15毫米x15毫米,切片厚度= 0.5毫米,切片数量= 30),矢状面(TR/TE=350/80/39 ms,矩阵尺寸= 128 x 256,视野= 16 mm x 32 mm,切片厚度= 0.5毫米,切片数= 24)定向分析3D切片机进行MRI图像(外科规划实验室)。打开冠状面图像,并添加了一个新的分割方法。. 通过只绘制包含大脑的图像区域,为整个大脑创建了感兴趣的区域。这种情况一直持续到所有的切片上,直到整个大脑都被画了出来。大脑的体积是通过测量根据体素尺寸计算出的绘制区域的体积来确定的。同样,对小脑进行了第二次分割,并以同样的方式计算其体积。

    计算机断层扫描

    计算机断层扫描(CT)是在西门子Inveon PET/CT系统(西门子公司)上进行的,分辨频率为45 mm各向同性分辨率。小鼠被麻醉和支持如上所述。总扫描时间为16分34秒。使用Inveon研究工作场所软件(西门子)完成对CT图像的分析。L1-L10的测量值是根据预定义的测量位置来确定的(见图S1)。

     

    细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日e5


     

     

    步态分析

    一条60厘米长、5厘米宽的跑道上衬有特曼纸。小鼠(2周至6个月)在进行实验前被训练穿过跑道。老鼠的爪子被涂上了两种不同的颜色,分别作为前肢(蓝色)和后肢(红色)。. 对于每只小鼠,至少记录3次跑步(每只动物30-45步),并分析每只肢体的步态比(b/a)由左爪到左(a)和相应的右爪(b)之间的足迹距离(DOI:10.11111/j.1601-183X.2004.00072.x)确定。96可视化情况见图1I。

    神经管成像

    野生型C57BL/6J(JAX#000664)、Rosa 26 mT/mG(JAX # 007676)、Shh-Cre(JAX#005622)、Shh::gfp(JAX#008466)、Myo10m1J(JAX#024583)和C57BL/6背景下的Disp1突变体胚胎,并进行免疫组化处理。采用E8.5 (8-15体)或E9.5 (25-30体)期胚胎进行分析,并比较相同体数量的胚胎。取妊娠母鼠,取子宫角,用1X PBS解剖胚胎,然后冲洗3次。整个胚胎在立体显微镜(徕卡)上进行成像。胚胎在室温下用4% PFA固定1小时,用1X PBS冲洗3次,然后移至30%蔗糖中进行冷冻保护。第二天,胚胎被冷冻在O.C.T.中干冰上的化合物(组织-Tek)。胚胎在徕卡微米CM1950低温恒温器上以10 mm厚的横向切片。切片短暂干燥,用1X TBST洗涤,然后用2% BSA、1%山羊血清、0.1% Triton-X-100在1X PBS中封闭。抗体在封闭缓冲液中稀释,在加湿室中室温孵育过夜。使用以下抗体和稀释剂:鸡抗GFP(1:500,牛,GFP-1020)、小鼠抗PAX6(1:25,DSHB,PAX6)、兔抗OLIG2(1:300,微孔,AB9610)、兔抗FOXA2(1:250,ab108422)、兔抗OLIG3(1:500,热费舍尔,JE56-40)、兔抗pSMAD1/5/9(1:1000,CST,13820)和兔抗NKX2.2(1:200,Novus Bio、NBP1-82554)。去除一抗,切片用1XTBST洗涤3次,然后用1:500稀释的二抗(Invitrogen)孵育3小时。切片用1XTBST洗涤3次,然后用自来水冲洗,干燥,然后用延长金刚石安装介质涂抹覆盖物。切片在徕卡DMi8广角显微镜上成像,并使用LAS X进行处理。每个基因型至少分析5个胚胎。

    对于RNAscope,采集E9.5胚胎,固定,包埋,并按上述方法进行切片。安装后,切片按照制造商的协议(文件323100-USM)用MmGli1-C1探针,使用RNAscopem多重荧光试剂Kitv2(ACD)对mm1-C1探针(ACDBio #311001)进行染色。抗原提取10分钟,蛋白酶-iii处理30分钟。对于信号的发展,Opal-570在1:1000时使用。

    对于原位杂交,收集E9.5胚胎并在4时固定4小时C在4% PFA。原位杂交实验如前所述(DOI: 10.3791/2912)进行97并进行以下修改。冷冻胚胎在15毫米厚下横向切片,并安装在带电的玻片上。感觉和抗感地高辛标记的RNA探针按照制造商的说明使用DIG RNA标记试剂盒(Roche)制作。用感觉探针作为阴性对照,未观察到阳性信号。每个基因型分析3个胚胎。

    使用斐济(ImiageJ)(DOI:10.1038/nmeth019)对神经管切片进行定量分析。.288所有的分析均在心脏水平的横切面上进行,通过鳃囊、主动脉囊的位置和心房/心室的大小/形态来确定。小鼠发育板19b的考夫曼图谱图像g-h显示了我们所示的心脏水平图像图2的区域,并进行了表达域定量分析。98通过测量神经元祖细胞标记物(PAX6、OLIG2、NKX2.2、FOXA2)相对于整个神经管区域的表达域面积,分析位于体2附近的横向心脏水平切片。每个基因型分析3~5个胚胎,每个胚胎分析5~8个切片。通过测量所示表达域的面积,并将其归一化为每个切片中所分析的神经管的总面积,来计算表达域面积。

    表达域强度线绘图数据如之前报道的那样生成(DOI: 10.1371/journal。pbio.1002119).99简单地说,通过神经管两侧的神经上皮细胞的中心团块,追踪出一条20像素宽的线。从底板中线的底面到顶板中线的基面。每个基因型有3个胚胎,每个胚胎共分析4-8个切片。除Gli1原位杂交图未转化且基于检测到的荧光外,单个线图归一化,最小值设置为0,最大值设置为100。数据用所有线± SEM的平均强度表示。与线形图数据一样,测量祖细胞标记物的相对和绝对背侧/腹侧位置,其值基于从底板中线通过神经上皮细胞中心质量到顶板中线的距离。相对位置值被确定为每个分析切片的总FP与RP轨迹长度的比值。记录每个标记物的表达域、背侧起始位置和腹侧端点,并进行不同基因型间的比较。从FP中线到RP的直线测量垂直D/V长度。每个基因型有3个胚胎,每个胚胎有5~8个切片。

    小鼠胚胎中细胞素的保存和成像

    准备对胚胎进行细胞素分析(DOI: 10.3791/64100)。57胚胎被解剖成不完全生长的培养基,然后用汉克斯平衡盐溶液(HBSS)冲洗。胚胎在HBSS+4%多聚甲醛中轻轻摇晃固定45分钟。固定后,用含Ca的PBS洗涤胚胎3次2+和镁2+和0.1%的Triton,每次洗30分钟。胚胎在块状(含Ca2+和镁2+,0.1%的Triton,和5%的山羊

     

    e6细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


     

     


     

     

    血清)与温和的搅拌。然后胚胎在一抗溶液中孵育(抗体用PBS稀释2+和镁2+,0.1% Tween-20和5%山羊血清)472小时C与温和的摇摆。使用以下抗体:鸡抗GFP(1:250,Aves、GFP-1020)、小鼠抗SHH(1:100、DSHB、5E1上清)、兔抗Olig2(1:300、微孔、AB9610)和兔抗ARL13B(1:500,蛋白蛋白,17711-1-AP)。初次孵育后,胚胎在温和搅拌下连续洗涤5次,持续1小时。胚胎在F(ab’)中孵育2片段二抗溶液(1:1000抗体稀释)72小时,轻轻旋转4小时C在黑暗中。如果不需要肌动蛋白染色,胚胎与DAPI孵育1小时,然后用方块洗涤3次,每次10分钟。最后一系列用PBS洗涤三次20分钟2+和镁2+,取0.1% Tween-20,包埋前将胚胎保存在溶液中。

    胚胎用4%的低熔点琼脂糖溶解在HBSS或PBS中2+和镁2+.包埋的胚胎用100或150毫米的振动计进行切片。f-肌动蛋白染色,切片用放线菌(热fisher)和DAPI孵育40分钟,然后切片用块洗涤一次,然后用Ca在PBS中洗涤两次. 2+和镁2+,0.1% Tween-20,每次洗20分钟。切片用延长金刚石法安装在载玻片上。组织切片用TCS SP8 STED 3X共聚焦显微镜(徕卡)成像,然后在光子计数模式下进行闪电反褶积计数或卫星tauSTED(徕卡)成像。每个基因型至少有3个胚胎被分析,所有基因型之间的比较进行相同数量的体匹配胚胎。为了减轻来自低水平非特异性GFP信号的干扰,所有SHH的体内定量均使用抗SHH信号进行计算。

    细胞培养中细胞素的保存与分析

    细胞固定和染色采用mem固定方案(DOI: 10.21769/BioProtoc。2898).100转染后再复制到盖玻片上,细胞用4%甲醛、0.5%戊二醛和0固定。1M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)溶液,持续7分钟。从这一点开始,所有的溶液都被轻轻地移液,以减少在清洗期间对盘子的搅拌。固定后,用PBS洗涤细胞3次,每次洗涤5分钟。细胞在由5%正常山羊血清和0.1% Triton X-100组成的缓冲液中渗透,1 mg/mlNaBH4溶液在蒸馏水中溶解45分钟。有关抗体孵育的详细信息,请参阅“免疫荧光和成像染色方案”部分。

    我们将用于定量的细胞素定义为直径约为<200 nm、最小长度为10 mm的细胞投射物(DOI: 10.7554/eLife。61432).36任何沿着其整个长度与覆盖物保持持续接触的细胞突起都被排除在分析之外。100细胞素发生率计数在3个覆盖物中至少100个细胞,至少2个生物重复。细胞素与细胞体的平均荧光强度比是通过测量单个细胞素的平均荧光强度超过其原始细胞体的平均荧光强度来计算的,每个条件下共分析n=44-80个细胞素。通过测定2个生物重复中n=44或46个细胞素内每个蛋白的相对荧光强度比,分析DISP变异与SHH-GFP的线性回归分析。

    使用Ca测量基于细胞素的SHH信号激活2+SHH接收细胞的通量速率如下所述。36. 简单地说,将2 mg质粒DNA转染到6孔板pCMV-R-GECO1的单个孔细胞中,用于NIH3T3“接收”传感器细胞,将pCDNA3-mSHH-FL-EGFP用于DISP变体MEF“产生”细胞。转染24小时后,细胞被胰蛋白酶化,并复制到8个孔,聚苯乙烯室,放置在1.5硼硅酸盐盖玻璃上,0.7厘米2/嗯(Nunc实验室-TekII)。将细胞接种到以…40%的细胞密度(20% R-GECO,20% SHH-GFP)培养出来的腔室孔中,并在成像前恢复至少4小时。在PBS中轻轻清洗细胞,在成像前用新鲜培养基替换培养基以去除分泌的SHH,以确保信号来自细胞素传递的配体。在37岁时进行了实时成像C, 5% CO2. 在整个细胞素深度(…4-6mm)上,每个区域进行15 min的共振扫描,z步长为…0.6-1.0mm生成最大强度投影,用于后续的时间间隔分析。对每个细胞的R-GECO荧光强度直方图进行归一化处理,最小荧光为0,最大荧光为100。加拿大2+通量的发生被量化为R-GECO荧光的相对峰值,最小荧光峰值为50。只有与来自SHH-GFP产生细胞的细胞素接触的R-GECO细胞被定量进行分析,任何在扫描期间没有显示出单一通量的R-GECO细胞都被排除在分析之外。从3个生物重复中,每个条件下共分析了n个=31-41个细胞。

    脊索和神经管腔内沿细胞素的SHH斑点分析

    我们开发了一个工作流程管道来量化从脊索到周围细胞和组织的数量。未处理的抗SHH通道从。使用斐济(图像J)从扫描系列中提取以0.33mmz步间隔拍摄的50-90张图像. 88并进行快速傅里叶变换(FFT)带通滤波。其余的通道染色(DAPI,F-actin,anti-GFP)被合并并总结作为一个细胞轮廓掩膜。然后通过Ilastik(DOI: 10.1038/s41592-019-0582-9)运行单元格轮廓掩码系列90训练生成一个定义细胞体和细胞素的分割掩模系列。然后将分割掩模和过滤后的SHH系列在斐济进行重组88与图像计算器的功能。通过阈值法(阈值法采用最大熵分析,范围为10-100)确定SHH斑点,然后将粒子分析设置为10-60像素,以排除过小或过大的斑点。每个基因型分析了9到15个组织切片,代表440-797张图像。

    通过阈值化和计数前10 mm内的管腔SHH斑点,对E8.5胚胎的管腔SHH斑点进行定量

    (…30个z步)的组织切片与斐济。88在连续的z步中,相同位置的斑点只计算一次。共计

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    . 分析每个基因型6-8个胚胎的18-20个切片,以量化SHH神经管腔(NTL)信号强度,沿NTL绘制一个感兴趣区域(ROI),并在NT细胞体内绘制第二个ROI作为背景校正。每个切片的平均信号强度由平均NTL信号减去平均NT信号来确定。所有的体内定量均采用抗SHH信号进行。

    测序

    显示器1CS/+雌性与Disp1杂交印第安纳州/+雄性产生E9.5对照(野生型)和Disp1CS/INDEL晶胚同样,Myo10m1J/+雌性与Myo10杂交m1J/+雄性产生E8.5对照(Myo10+/+)和Myo10m1J/m1J晶胚收集多个窝,每个基因型使用5对体匹配的窝崽(5个对照,5个突变体),以最大限度地提高遗传变异。采集妊娠母鼠,解剖胚胎,每个胚胎置于1.5 mL的埃彭多夫管中,在液氮中快速冷冻,然后在-80℃保存,进行基因分型。一旦产生5对胚胎,所有样本同时纯化。每个整个胚胎均质,使用RNeasy Micro Kit(Qiagen)使用制造商的协议提取RNA。每个样本根据manufacturer‘sinstructions,使用RruSeqRNA样本Prep v2试剂盒(Illumina)制备1 mg的RNA测序文库,并在Illumina NovaSeq 6000上完成测序。使用CLC基因组学工作台v20.0.4(10agen)筛选质量(类似Q20或更长),并与小鼠参考序列GRCm39(UCSC mm39)对齐。TPM(每百万转录本)计数由CLC RNA-Seq分析工具生成。差异基因表达分析采用非参数方差分析,使用Kruskal-Wallis和Dunn对两个实验组的对数转换的检验,在Partek基因组套件v7.0软件(Partek Inc.)中实现。使用GSEA (DOI: 10.1073/pnas。0506580102).93数据集已存储在基因表达综合系统上,并可在登录号(GSE242161)下公开获得。

    细胞培养用的免疫荧光和图像采集

    细胞在覆盖物上生长,然后用PBS冲洗3次,4%多聚甲醛固定,然后用0.1%Triton+PBS冲洗3次5分钟,用块孵育(PBS,0。兔抗SHH(1:100、160)、1:800、46449)、兔抗V5(1:300、1:200、CST、Pk1)、兔抗Rab11(1:1:800、1:200、1:200、CA2)、CST、51:1)、1:100)、兔抗网格蛋白重链(1:1:100、CST、4796)。. . 第二天,用块洗涤3次,10分钟,使用二抗(杰克逊免疫研究和邀请试剂),1:1000稀释,加入DAPI和肌动蛋白红(邀请试剂)孵育1小时。使用延长玻璃抗褪色支架(Invitrogen)清洗和安装盖板。显微镜图像用TCS SP8 STED 3X共聚焦显微镜(Leica)或A1R共聚焦(尼康)拍摄,用于固定和活细胞成像。

    图像处理与分析

    图像采集后,使用LAS X(Leica)、ImageJ、88和Photoshop 2022(Adobe),并使用插画家2022(Adobe)制作数字。在TCS SP8 STED 3X共聚焦显微镜上获得的神经管细胞质镜成像,使用闪电软件(徕卡)进行反褶积。用ImageJ处理视频,88LAS X,Amira(ThermoFisher)和首映式Pro(Adobe)。EM图像数据使用Amira(热莫费舍尔)、Ilastik、90以及用于大量图像数据的协作注释工具包(猫女)(DOI:10.1093/bioinformatics/btp266)。72,91除非另有说明,图像以跨越单元或感兴趣区域的z-堆栈采集的最大强度投影(MIP)表示。除非另有说明,所显示的图像代表了在多个实验中至少三个生物复制的标准细胞或组织切片。

    质粒

    在本研究中使用了以下质粒:

    pCDNA(控制载体)(克隆技术V79020),pCMV3-hBMP2-GFPSpark(中国生物HG10426-ACG),pCMV3-hBMP4-OBMP4-OFPSpark(中国生物HG10609-ACR),pCMV3-hBMP7-GFP-GFPSpark(中国生物HG10083-ACG),pCMV3-hWNT1-GFPSpark(中国生物HG10721-ACG),pCDNA3-EGFP(添加基因质粒#13031),pCMV-m樱桃膜86(Addgene质粒#55779),pCMV-R-GECO187(Addgene质粒#32444),pCMV-mCherry2(Addgene质粒#54517),pCDNA3.1-mSHH-FL,39pCDNA3.1mSHH-FL-EGFP,36pCDNA3.1-mSHH-FL-mCherry2,36pCDNA3.1-V5-DISP重量-HA39(加增基因质粒#126410),pCDNA3.1-V5DISPCS-HA,39pCDNA3.1-V5-DISPΔC-HA, pCDNA3.1-V5-DISP4xAA-HA, pCDNA3.1-V5-DISP重量-Dronpa3-HA, pCDNA3.1-V5-DISPCS- Dronpa3-HA, pCDNA3.1-DISPΔC-Dronpa3-HA.Dronpa3构建物来自Dronpa3-N1(Addgene质粒#54682),并插入到DISP残基A695和V696之间。Dronpa3PCR(NEB)酶切位点扩增后,用Phusion PCR(NEB)扩增到IC3。AP2/网格蛋白结合突变体DISPΔC和DISP4xAA使用Quik改变诱变技术(Quik Change II XL定点诱变试剂盒,安捷伦,200522)创建。

    Dronpa3 BsrG1引物:

    Forward:5' tatagatccACCGGTCtgtacaATGGTGAGTGTGATT 3'

     

    e8细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


     

     


     

     

    反向: 5‘ tataAGTCGCGGCCGCCTAtgtacaCTTGGCCTGCCT 3”

    快速更换引物:

    c端删除5‘gagccaggctcagccCTCGAGtacccctac 3’

    DISP1 L1249/1250A引物:

    前进: 5‘ ccaggctcagccgcggcgcagtcctgtctg 3”

    反向: 5‘ cagacaggactgcgccgcggctgagcctgg 3”

    DISP1 L1324/1325A引物:

    前进: 5‘ caagccgccgagggcgctgcgcaccctgcccag 3”

    反向: 5‘ ctgggcagggtgcgcagcgccctcggcggcttg 3”

    DISP1 L1441/1442A引物:

    前进: 5‘ gtggagccaagcgcggcgcagaccgatgaa 3”

    反向: 5‘ ttcatcggtctgcgccgcgcttggctccac 3”

    DISP1 L1516/1517A引物:

    前进: 5‘ actcagacctgtctggcgagagtgcggcaataaaaacactactcgagtacc 3”

    反向: 5‘ ggtactcgagtagtgtttttattgccgcactctcgccagacaggtctgagt 3”

    蛋白质稳定性环己酰亚胺测定法

    分配Flp-Inmef稳定表达V5-DISP重量-HA或V5-DISPCS-HA瞬时转染pCDNA3.1-mSHH-FL或空载体对照。转染后,将细胞复制到60 mm内2组织培养皿,培养过夜。. 将环己酰亚胺(20mg/mL,溶解在DMSO中)加入到所有平板中,用0、2、4、6、8、1倍RIPA缓冲液裂解12小时(Thermo科学)。. 细胞裂解物的蛋白质含量归一化,用westernblot检测DISP(大鼠抗ha,1:2000,Roche,11867423001)和装载对照小鼠抗微管蛋白(1:1微管蛋白10000,CST,DM1A)。使用密度测定法(ImageJ)计算剩余蛋白的比例88的时间点除以0个时间点的密度测量法。

    免疫印迹法和免疫共沉淀法

    为了进行蛋白印迹,SDS-PAGE样品在4-15%三甘氨酸SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)上运行,并使用Tris/甘氨酸/SDS缓冲液(Bio-Rad)转移到固定p PVDF(微孔)上,1小时。在室温下,用5%的牛奶和0.1% Tween-20(TBST)或5% BSA inTBST的tris缓冲盐水封闭膜1小时。抗体稀释度为抗HA(1:3000;罗氏3F10)、抗V5(1:2000;生命技术SV5-Pk1)、抗SHH(1:2000;CST C9C5)、兔抗驱动蛋白(抗Kif5B,1:5000;Abcam ab167429)和/或微管蛋白(1:10000;CST DM1A),阿尔法适应蛋白(1:1000,热科学AC1-M11)(1:1000,贝氏生物科学A304-718A)。相应的HRP偶联二抗(Jackson免疫)孵育1 hrat RT ata 1:5000浓度。红外抗体(Li-Cor)在双联时使用HRP偶联抗体的1:10000浓度。印迹是通过使用奥德赛Fc(Li-Cor)和ECL Prime(GE)开发的。

    如Marada等人所述,进行了生物素化分析和随后的密度测定法。(DOI: 10.1371/journal.pgen.1005473).101简单地说,活细胞用冷PBS(pH 7.4)洗涤3次,然后在4时轻轻摇晃30分钟C在含有0.5 mg/ml EZ-LinkSulfo-nhs-生物素的PBS中(热科学)。生物素化通过用含有50 mMTris的冷PBS洗涤两次细胞来猝灭。收集细胞并用RIPA缓冲液裂解。裂解液与50 ml链霉亲和素琼脂糖珠(热科学)一起孵育1小时C. 然后用RIPA缓冲液洗涤珠子三次,在含有2 mM游离生物素的煮沸样品缓冲液中提取珠子结合蛋白。用SDS-PAGE和western blot分析上清液和链霉亲和素珠洗脱后的蛋白。使用斐济进行密度分析,并测定链霉亲和素结合的细胞表面与裂解液DISP的信号密度比值。

    为了进行免疫沉淀,将稳定表达全长SHH的小鼠胚胎成纤维细胞瞬时转染,表达野生型、CS突变体或ΔC DISP蛋白。然后培养细胞,在修饰的HK缓冲液(20mM HEPES,10 mM氯化钾;pH 7.9)+ 2.5%甘油+50mM氯化钠)中分离质膜组分。102蛋白质含量归一化,膜组分用蛋白A/G Plus琼脂糖(Santa Cruz SC-2003)预清除,样品用EZview Red抗HA亲和凝胶(E6779-1ML,微孔Sigma)在4C下免疫沉淀1.5小时。然后在室温下在裂解缓冲液和150 mM氯化钠中洗涤3 x 5 min,并在室温下在5X SDS缓冲液中洗脱。采用SDS-PAGE和免疫印迹分析AP2和HA(A(1:101011)、β(1:1000,贝氏生物科学A304-718A)、HA (1:3000,罗氏,3F10)。

    球体生成与分析

    使用稳定表达野生型或CS突变型V5-DISP-HA蛋白和强力霉素诱导的SHH的IMCD3细胞生成球状体(DOI: 10.1038/nprot181)。.2014.51球体固定前24小时,用100ng/mL的强力霉素培养基诱导SHH表达。第二天,球状体被固定和染色。51对球状体进行兔抗shh(1:100,Santa Cruz,H-160)、大鼠抗ha(1:250,Roche,3F10)、小鼠抗v5(1:300,生命技术,SV5-Pk1)染色。二抗染色时进行F-actin和DAPI染色(1:1000)。染色后,IMCD3球状体安装在荧光计-g(ThermoFisher)中,并在尼康A1R扫描共聚焦显微镜上成像。

     

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    以0.4 μm的间隔对整个球状体进行扫描。只有包含明确管腔的球状体和单层细胞被用于分析。对细胞中心的单个细胞进行分析(DAPI占细胞最大体积)。单个细胞的顶端和基底表面由最大的f-肌动蛋白荧光来定义。HA的DISP定位分布曲线计算为沿基底至顶端细胞膜的强度线曲线。数据归一化为1,每个条件下分析n= 21-29个细胞,取自多个实验的3个生物重复。对于顶端超过基础荧光强度比,测量细胞的顶端和基础表面的平均强度值(由峰值f-肌动蛋白强度定义),并对每个细胞进行比较。值<1表示主要是基础蛋白积累,>1表示根尖积累(腔面),每个条件下有n= 40-47个细胞。

    共定位分析

    在单个细胞的内吞体区域内分析DISP-HA和单个内吞体标记物之间的共定位。Pearson的相关系数值代表了所分析的内吞体腔室内的DISP的部分,并不代表整个细胞体积。为了进行分析,扫描的细胞体积作为最大强度投影(MIPs)。伊拉斯蒂克90用于内体染色的输出MIPs,生成突出内体标记物的分割掩膜。然后,mip和掩码通过细胞分析器中的一个辅助管道运行(DOI: 10.1371/journal。pbio.2005970)89在测量皮尔逊相关系数的同时测量皮尔逊相关系数。输入图像包括1)f-肌动蛋白或SHH-mCherry(瞬时转染mef)轮廓和分段单个细胞在扫描区域,2) DAPI作为参考节点f-肌动蛋白分割和数量细胞每个扫描区域,3) HA测量DISP,4)内吞体标记测量感兴趣的内吞体标记,和5)分割面具细化共定位内吞体分析区域标记。对标记物进行分类并输入管道,根据HA和内体标记物的适当阈值,计算内体室内每个细胞的相关系数。输出数据中低于曾15百分位的任何f-肌动蛋白标记的细胞区域被排除在数据集中,以避免死亡或细胞部分。在这些实验中,=60-126对照转染细胞和=23-39转染的SHH细胞从3个生物重复中进行了分析。

    DISP膜内化

    MDCK cellsexpressing DISP重量-Dronpa3, DISPCS-Dronpa3或DISPΔC-Dronpa3被镀在Lab-Tek II室载玻片上,并允许其生长,直到它们形成单层。抽吸细胞培养基,用含有10 mM HEPES的无血清培养基替换。细胞用aTCSSP8 STED 3x共聚焦显微镜(徕卡)成像,配备enclosureboxheatedto37C,5%CO2for80minutesat2.5-minuteincrementswithz-seriescoveringtheentirecellvolumeofthemonolayer.对DISP-Dronpa3构建物进行成像30分钟,以监测任何光漂白或光毒性的影响(未检测到)。在培养基中加入25 μM Pitstop 2(ab120687,abcam,溶解在DMSO中),阻断内吞作用,导致DISP-Dronpa3在细胞表面上积累30分钟。随后,将含有10%胎牛血清的培养基替换Pitstop2治疗的无血清培养基,然后每2.5分钟继续成像50分钟,以测量恢复情况。

    在这个时间过程中,通过ROI沿着相邻细胞膜的细胞-细胞界面进行标记来测量DISP-Dronpa3构建物的膜积累和随后的内化率。使用LAS X软件记录Dronpa3沿膜的荧光强度。在添加Pitstop 2为1后,将每个ROI的数据归一化,时间点0的荧光强度归一化。在Pitstop 2洗脱后,时间点0的荧光强度也被归一化为1。每个条件下从3个生物重复中分析n=31-57个细胞roi。

    荧光素酶报告分析

    分配稳定表达MSCV-Hygro或MSCV Hygro-Shh的mef以5 3 10的密度播种56孔板中的每孔细胞。第二天,将pcDNA3-V5-WT Disp-HA(3 μg)或pcDNA3-V5-CS Disp-HA(3 μg)转染到Disp中表达载体或Shh的细胞。同时,聚苯乙烯克隆缸(内径9.5mm的x 6.2 mm高度,科学软件,Bel-Art)在70%乙醇消毒,在无菌PBS洗涤,干燥,放置在12孔的中心孔板,创建一个障碍的内环和外环之间的井,如前所述。39Shh Light II报告细胞103,104是在1 3 10点播种的吗5圆柱体外环周围的细胞。分配转染了Disp表达载体的稳定细胞以5 3 10的密度接种4圆柱体内环内每口孔的单元。细胞在允许之间恢复。第二天,从细胞中移除培养基,并移除圆柱体,在Shh Light II和Disp之间形成一个无细胞的屏障细胞细胞用PBS洗涤3次,然后用DMEM无血清完全培养基洗涤。每孔中均加入DMEM无血清完全培养基,孵育2小时。每2小时更换一次,共6小时。6小时后,每孔加入1 mL DMEM无血清完全培养基,让细胞孵育曾36小时。报告基因检测根据双荧光素酶报告试剂盒说明(Promega)进行。实验重复三次,重复三次,所有数据合并。

    扫描电镜和定量

    E9.5胚胎(n=8)固定在2.5%戊二醛、2%多聚甲醛和含2 mM MgCl的0.1 M碳酸钙缓冲液中2.固定后,将样本斩首,然后将一根针插入前神经管,将胚胎平分

     

    e10细胞187,1–18.e1-e11,2024年1月18日


     

     


     

     

    矢状面暴露神经管腔、底板和脊索的内部。解剖样品用缓冲液洗涤,0.1%四氧化锇水溶液固定1小时,用ddH洗涤2O,用上升的乙醇系列脱水,临界点在液体CO中干燥2使用自动采样931(图动)。干燥的样品在15 nm铱的行星旋转下溅射涂层,并使用埃弗哈特-索恩利和T1探测器在2 kV的热费舍尔科学透镜扫描电子显微镜下成像。用Ilastik分离延伸和初级纤毛,对神经管腔细胞延伸到初级纤毛接触进行显微镜分析90生成分割掩码。利用二次手动分割来验证纤毛。然后将分割掩模输入到ImageJ中88通过曼德斯系数分析来分配对象计数和测量覆盖(接触),每个基因型分析了4到10张显微照片,共计1784条初级纤毛和39070张延伸(n=344 Disp1. +/+, n=684 Disp1印第安纳州/+和n=756 Disp1英德尔初级纤毛)。扩展计数包含的阈值被调整为包含在每个显微照片中大于纤毛的任何物体。我们通过人工计数一个胚胎上的纤毛接触(从5张显微照片中总共有389个初级纤毛),验证了我们的自动管道的准确性。胚胎自动分析确定53.89%的初级纤毛与细胞延伸接触,SD为15.44,而人工分析确定52.18%与SD接触为10.16接触,表明我们的管道是准确的。

    连续块面扫描电镜

    E9.5 Disp1+/+, Disp1CS/+, Disp1印第安纳州/+, Disp1CS/INDEL, Disp1英德尔, Myo10+/m1J和Myo10m1J/m1J胚胎被固定在2.5%胚胎中戊二醛,2%多聚甲醛在0.1M碳酸氢酸盐缓冲液中。固定后,样品在室温下在2%四氧化锇碘化缓冲液中固定90分钟,然后直接转移到碳酸氢盐缓冲液中的2.5%亚铁氰化钾中。样品用ddH2O彻底冲洗,40时孵育C在1%硫脲酰肼中浸泡45分钟,然后再次彻底清洗,然后在2%四氧化锇水溶液中室温孵育90分钟。样品用ddH2O冲洗,并在1%的醋酸铀酰水溶液中孵育过夜然后C被加热到50C30分钟,在室温下保持1小时,恢复到50. 用ddH2O彻底冲洗后,样品在一系列上升的乙醇中脱水,在环氧丙烷中过渡,并用EMBed-812环氧树脂渗透。100% EMBed-812中的样品在60处聚合C2天。选定的样品被裁剪、安装、涂上铱,并安装在赛默费舍尔科学型体积镜扫描电镜中进行成像。成像条件,包括为了缓解电荷的水蒸气压力,根据每个样品进行调整,以确保一致的成像和切割。每个基因型至少有2个胚胎,每个胚胎进行2个个体扫描系列。单个扫描系列由大约500-1000个连续切片组成,组织深度为50-100mm,X,Y分辨率为20-40x20-40nm/像素,连续切片为60-100nm间隔。用Amira(ThermoFisher)生成片段对齐和体积渲染的单个细胞。数据集被上传到猫女那里72,91用于量化细胞延伸的长度和频率。膜延伸被分割,并通过整个扫描区域的连续切片进行单独映射,直到它们的终点或细胞-细胞膜密度超过分辨率,阻止了进一步的延伸映射。从10个连续切片(…1mm深度)的延伸/核值进行定量,以确认膜泡是连续延伸的,每个胚胎分析1mm厚的切片系列。. 5-10

    量化与统计分析

    每个实验中使用的小鼠的数量和发育阶段在图形或图形图例中给出。在分析中使用的额外数字(n)包括在方法细节中用于个别实验。实验没有以盲法进行,除了分析……MYO10实验中的E8.5胚胎,如图7所示。所有统计分析均采用GraphPad Prism进行。多重比较采用单因素方差分析,以Tukey的多重比较作为后检验。两种条件之间的显著差异由双尾学生st检验确定。共定位定量采用细胞分析仪进行89或ImageJ(斐济)88在适当的情况下,用皮尔逊相关系数或曼德的记分系数进行分析。除非另有说明,所有量化数据均以平均± SD表示,p<0.05被认为具有统计学意义。显著性描述为**<0.05,**p<0.01,***p<0.001,****p<0。. 0001,ns =不显著。

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

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    图S1。CRISPR-cas9生成的Disp1突变小鼠表现出表型,与图1相关

    利用(A) CRISPR-Cas9基因靶向技术,生成了一个在DISP第一个细胞外环中保守的Furin切割位点发生突变的敲除小鼠。基因靶向导致产生所需的等位基因(278RRE到AAA,Disp1CS)和一个11个碱基对的缺失突变体(Disp1英德尔).DISP蛋白的示意图显示了Furin裂解位点以及用于生化和细胞生物学分析的V5和HA表位标签。该基因敲除的小鼠没有V5或HA表位标签。指出了DISP甾醇传感域(SSD)和转运体基序。

    (带C) P35 Disp1CS/CS小鼠表现出可变的脑积水(B0),但与同窝对照动物相比,体型没有明显减少。(下页继续图例)

    (D) P0 Disp1CS/INDEL幼崽比同窝的对照组小鼠要小。

    (E)与图1D对应的冠状面MRI0显示为Disp1CS/+和显示器1CS/INDEL老鼠

    (F)microct生成的男性头骨的3D渲染CS/+和显示器1CS/INDEL老鼠显示。

    (G) MicroCT线性测量标志,用于分析颅骨沿矢状面和水平面的MicroCT线性测量标志显示。

    (G0)从12个Disp1中计算出的指示地标(L1-L10)的线性测量结果CS/+和10 Disp1CS/INDEL老鼠合并男性和女性的数据,结果显示为平均± SD。



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    S2。E9.5对照和Disp1的基因表达分析CS/INDEL突变体胚胎,与图2相关

    (A)箱形图显示了所示基因型的E9.5/27-29体细胞胚胎的祖细胞结构域的绝对边界。从FP开始的腹侧的位置显示在每个盒子的底部,而背侧的位置显示在每个盒子的顶部。

    (A0)显示了相应的指示基因型E9.5胚胎神经管的平均垂直DV长度。n = 3个胚胎,每个胚胎测量5-8个切片。数据以平均±SD显著性表示,表示为*p < 0.05,****p < 0.0001,ns =不显著。.

    (C带)Gli1原位杂交的心脏水平切片的E9.5/27-29体细胞胚胎的指示基因型显示。显示器1CS/INDEL与对照组相比,神经管对Gli1的诱导作用减少,表明SHH靶基因的激活减少。

    (D)这是一个原木的火山图10的p值。Disp1中mRNA表达的对数比倍变化CS/INDEL胚胎与Disp1比较+/+胚胎(每个基因型为n=4)。p值<为0.01和log的基因2比值>为0.5(右上象限)和<为0.5(左上象限)。

    (下页继续图例)


    (E)京都基因和基因组百科全书(KEGG)差异表达基因的通路分析。在Disp1中富集的基因集的归一化富集分数CS/INDEL胚胎与Disp1比较+/+通过基因集合富集分析(GSEA)来确定。黑色为正富集通路,灰色为负富集通路。

    (F)根据对数尺度上的顶级差异调控基因的热图进行排序(每个基因型n=4)。

    (G)在Disp1中富含差异调控基因的Wiki通路CS/INDEL胚胎与Disp1比较+/+对照与p < 0.05(352个基因)使用richR。

     

     

     

     

     

     

     

     

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    图S3。DISP细胞表面定位和稳定性分析,见图3和图4

    (A)细胞裂解物和(A0)共聚焦显微镜观察稳定表达WT或CS V5-DISP-HA蛋白的IMCD3细胞的球状体显示多西土霉素诱导的SHH。(A)橙色箭头标记已切割的DISP,蓝色箭头标记切割的DISP。a-微管蛋白是加载控制蛋白。(A0) DAPI为蓝色,SHH为黄色。

    (B)细胞表面生物素化进行细胞表面生物素化稳定表达WT和CS V5-DISP-HA蛋白。在链霉亲和素珠上收集生物素化蛋白,用蛋白印迹法进行分析。

    采用(C)环己酰亚胺(CHX)处理法检测DISP的稳定性重量和DISPCS没有或存在SHH的蛋白质。分别在添加CHX后0、2、4、6、8和12 h采集样品。western blot检测DISP-HA和a-Tub蛋白水平。(C0)DISP-HA蛋白的密度定量显示归一化为a-Tub。数据显示为3个生物重复的平均± SD。

    (D-G)内源性AP2和稳定表达的WT orCS DISP的代表性图像见DISPmef文件。这些是用于共定位分析的数据集的代表性图像0.在控制条件下,AP2(品红)和WT或CSDISP-HA(绿色)显示中等频率的共定位(D和E,箭头)。在表达shh的WT DISP-HA细胞中,HA和AP2的共定位增加,而在CS细胞中没有增加(F和G,箭头)。

    (H-M)内源性内吞标记物和稳定表达的DISP的代表性图像如图所示。箭头指向带有多个细胞的图像中表达shh的细胞。

    (N)在Disp中表达的V5-DISP-HA蛋白的细胞表面生物素化显示了mef。驱动蛋白是加载控制件。取3个单独实验的密度分析的平均值,以确定细胞表面与细胞内DISP蛋白的比例(洗脱:裂解液[HA])。

    (O) Disp将稳定表达Shh或空载体对照的mef瞬时转染V5-Disp-HA表达载体,然后与SHH light II报告细胞共培养。荧光素酶报告基因活性归一化为tk-肾,活性相对于DispMEF空向量控制(设置为1)。重复进行三次检测,所有数据合并。误差条表示SD。显著性由单因素方差分析确定。*p < 0.05,**p < 0.01,***p < 0.001,ns =不显著。


     


     

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    S4。在发育中的小鼠神经管中存在长时间的细胞延伸,与图5相关

    (A-C)E10.5腹侧神经管用抗GFP(绿色)和抗shh(洋红)免疫染色进行共定位分析,DAPI为蓝色,F-actin为红色。. (A)什+/+腹侧神经管在脊索(NC)和FP内具有较强的抗shh信号,而非特异性背景抗GFP信号较低。所有体内定量均采用抗shh信号。(B–B ”0)SHH中SHH和GFP信号的共定位GFP/+胚胎(B)0)插入放大显示在一个小的f-肌动蛋白阳性管腔延伸的顶端(箭头)。

    (C)小提琴图显示了抗Shh和抗GFP信号的%信号共定位的小提琴图+/+, ShhGFP/+, ShhGFP/GFP胚胎切片。点代表从2 Shh中分析的单个部分+/+, 3 ShhGFP/+和3 ShhGFP/GFP晶胚

    一个矢状平分的Disp1的(D)扫描电镜印第安纳州/+E9.5胚胎暴露神经管腔(NTL)、FP和邻近的NC。

    (E)Disp1的扫描电镜英德尔NTL从相邻细胞之间延伸的部分(绿色箭头)。

    (下页继续图例)


                         (FandG)(F)磁盘1的扫描电镜+/+(G) Disp1英德尔胚胎神经管腔和FP细胞。虚线表示管腔和暴露的FP之间的划分。在这两种基因型中,从FP延伸到管腔(绿色箭头)。连接相邻FP细胞的长延伸的例子用黑色箭头表示。黄色箭头表示沿着延伸处可以看到的凸起。

    (H)散点图显示了所指示基因型的神经管腔内的平均延伸密度。点表示所分析的单个扫描电镜显微图。

    (I)E9.5/25体scre的三维渲染;Rosa26mT/mG胚胎神经管腔显示shh标记的细胞素(黄色)来自memgfp标记的FP(绿色)。shh阳性的细胞素显示与ARL13B(青色)标记的初级纤毛接触。f-肌动蛋白用洋红色表示。

    (I0)显示了单个细胞素接触初级纤毛的痕迹。

    (J)显示了一个shh阳性细胞素接触接收细胞初级纤毛的单焦平面。SHH点(J0与arl13b标记的初级纤毛(J00箭84个与初级纤毛接触的fp衍生延伸物中有39个(46.4%)含有SHH。参见视频S2。

    (K–L0)从E9.5 Disp1中提取的单个SBF-SEM切片CS/INDEL(K)和Disp1英德尔(L)胚胎显示为神经管FP细胞。膜泡显示在缩放图像中(K0)和(L0)(用蓝色突出显示)。

    (M)图5K和图5L中的神经管的三维体积渲染显示了从腹侧到背侧的角度。A,前,P,后,见视频S4。. 数据以平均±SD显著性以**p < 0.01表示,****p < 0.0001表示,ns =不显著。.


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    S5。长细胞延伸连接脊索与FP和周围的间充质,与图6相关

    (Aand B)图6C中所示的脊索的3D渲染图,显示了间充质(青色)、脊索细胞(红色)和整个脊索(灰色)。神经管FP在(B).中显示为绿色参见视频S5。

    (C–C ") E8.5/10 somiteShh-Cre; Rosa26mT/mG脊索(NC)、神经管FP和邻近的体细胞分别染色为F-actin(洋红色)、GFP(绿色)、OLIG2(黄色)和DAPI(蓝色)。(C0-C”)NC产生的GFP和肌动蛋白阳性延伸(箭头)沿着FP表面移动,接触相邻的体细胞(箭头)。

    (D-F)所指示基因型的E9.5胚胎的NC和邻近FP的F-actin染色显示。f-actin阳性延伸在所有基因型中都很明显(箭头)。

     

    (下页继续图例)  


    (H)小提琴图显示了每个扫描步骤中f-actin阳性扩展中自动记录的SHH斑点的总数(图6L)。每个基因型分析n=440-796步。数据以带有1的中位数(实线)表示st 3rd四分位数(虚线)。

    (I)Shh中抗Shh的点状脊索向fp延伸的散点图GFP/+;Disp1印第安纳州/+,;Disp1CS/INDEL、和;Disp1英德尔胚胎切片。每个基因型至少2个胚胎,每个基因型4-9个切片,被分析并以非盲的方式人工定量。数据以平均±标准差表示。显著性为**p < 0.01,****p < 0.0001,ns =不显著。


     

     

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    S6。肌凝蛋白10有助于细胞素的形成,与图7相关

    (A-C)显示的具有代表性的E9.5胚胎。

    (D和E)(D)WT和(E) Myo10的单个SBF-SEM切片m1J/m1J神经管FPs与3D覆盖的猫女追踪延伸。颜色被任意分配,以提供与单个扩展的对比。参见视频S6。

    (F–G0)来自E8.5/10-12体期对照和Disp1的代表性心脏水平神经管切片CS/INDEL对胚胎进行OLIG2(红色)和DAPI(蓝色)染色。显示器1CS/INDEL胚胎表现出与Myo10相似的OLIG2腹侧转移和丢失的趋势m1J/m1J胚胎(图7G)。

    (H)Segmentedbargraphshowingtheproportionofcardiacleveltissuesectionswithnormal, ventrallyshifted, orabsentOLIG2stainingfromcontrolandDisp1CS/INDEL晶胚每个基因型有n = 3个胚胎,每个胚胎有6-15个切片,共分析27-35个切片。

    (I)E9.5WT胚胎的3D渲染显示了用F-actin染色的神经管顶板。f-actin阳性延伸从顶板和背侧神经管延伸到管腔(黄色箭头)。

    (J)Myo10中的细胞素发生率+/+(浅灰色)或Myo10-/-(深灰色)mef表达指示的荧光标记信号蛋白或GFP对照显示。数据以平均±标准差表示。以*p < 0.05,**p < 0.01,****p < 0.0001,ns =不显著。


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    图S7。Myo10RNA-seq分析m1J/m1JE8.5/8-10体细胞期胚胎,与图7相关

    (A)这是一个火山的原木图10的价值。日志2Myo10中mRNA表达的比值倍变化m1J/m1J胚胎与Myo10比较+/+胚胎(n = 4为Myo10+/+Myo10m1J/m1J).p<为0.05和log的基因2比值>0.5(右上象限)或<-0.5(左上象限)显示。对Myo10进行了GSEA检测m1J/m1J胚胎与Myo10比较+/+.

    (B)在Myo10中负向富集的生物过程、分子功能和细胞成分的前4个基因本体术语m1J/m1J胚胎代表。

    (C-E)富含(C)标志、(D)京都基因和基因组百科全书(KEGG)和(E)Myo10生成的Wiki信号通路m1J/m1J胚胎超过Myo10+/+(p < 0.001).Myo10的负富集m1J/m1J刺猬信号图(C0)来自标志数据库、轴突引导和Notch信号通路(D0和D00),来自KEGG数据库和Wnt信号通路(E0),来自Wiki路径数据库。

     

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